果膠酶協(xié)同漆酶/谷氨酸體系改善OCC造紙強度性能的研究

陳櫻珈 馬邕文 王祥槐 許超峰 張鳳山 許銀川 萬金泉，*

（1.華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州，510640；2.瑞辰星生物技術(shù)（廣州）有限公司，廣東廣州，510530；3.鄭州運達造紙設(shè)備有限公司，河南鄭州，451100；4.山東華泰紙業(yè)股份有限公司，山東東營，257335）

1 t 廢紙可生產(chǎn)約0.8 t 再生漿，可代替約3～4 m3的木材，同時減少了有毒廢物的排放，減少75%的空氣污染和35%的水污染[1]。但是再生纖維利用也存在著成紙濾水性能差、纖維潤脹性能差、纖維強度低等問題[2]，其被稱為“纖維性能的衰變”，因此需要采取一些方法來提高再生纖維的質(zhì)量。

生物酶具有修復效果好、反應條件溫和、對纖維損傷小、對環(huán)境無二次污染等優(yōu)點，被廣泛應用于制漿造紙工業(yè)中[3-6]。漆酶可以去除木素，從而提高紙漿漂白性能，增強纖維強度性能，陳國政等人[7]用羧甲基殼聚糖協(xié)同漆酶預處理廢舊瓦楞箱紙板（OCC），結(jié)果表明，經(jīng)過協(xié)同體系處理后紙漿的白度和強度得到提高，纖維間排列緊密，酸不溶木素含量下降。有研究表明，氨基酸在漆酶氧化后可以與木素發(fā)生邁克爾加成反應，從而將羧基嫁接到紙漿纖維上，增加纖維的溶脹性能，從而提高紙張的強度性能[8]。

纖維表面存在著大量木素和抽出物，這些物質(zhì)對纖維的覆蓋不利于纖維的潤脹，對后續(xù)纖維與其他藥品反應有一定的影響[9]。果膠酶可以部分去除纖維表面的木素和提取物，暴露出更多的碳水化合物和木素，從而提高后續(xù)加工的效率[10]。張向東[11]通過漆酶/介體和果膠酶的協(xié)同處理楊木堿性過氧化氫機械漿（APMP），研究表明，漆酶/介體和果膠酶的協(xié)同處理可以增加APMP 纖維之間的結(jié)合力，提高紙張的物理強度。

本研究以O(shè)CC 為原料，研究了果膠酶協(xié)同漆酶/谷氨酸的復合酶體系預處理對OCC 紙張強度性能的改善，并用響應曲面法優(yōu)化了酶預處理工藝條件，通過X 射線光電子能譜儀（XPS）、原子力顯微鏡（AFM）和傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）分析酶預處理對纖維表面物質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的影響。

1 實 驗

1.1 原料與試劑

廢舊瓦楞箱紙板（OCC），瑞辰星生物技術(shù)（廣州）有限公司；漆酶（酶活110×104U/L）、果膠酶（3×104U/g），上海麥克林生化科技有限公司；谷氨酸，上海伯奧生物科技有限公司；碳酸氫二鈉，分析純，福晨（天津）化學試劑有限公司；碳酸二氫鈉，分析純，國藥集團化學有限公司。

1.2 實驗儀器

HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；JB90-SH 恒速電動攪拌機（上海標本模型廠）；RK3AKWT 凱賽法自動抄紙器（奧地利PTI 公司）；CE062 抗張強度儀、CE180 耐破度測定儀、248 壓潰測試儀、009撕裂度測試儀（瑞典L&W 公司）；NanoscopeIIIa 原子力顯微鏡（美國）；Axis Ultra DLD 光電子能譜儀（英國Krates 公司）；Vector 33 傅里葉變換紅外光譜儀（德國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 OCC漿板的處理

將OCC 漿板用手撕成合適尺寸的小片，于室溫下在水中浸泡24 h，將泡好的廢紙調(diào)節(jié)漿濃約10%，在50℃、300 r/min的碎漿機中碎漿25 min。碎漿完成后用漿袋過濾收集漿料，平衡水分24 h以上備用。

1.3.2 OCC漿料預處理

稱取20 g 絕干OCC 漿料配成漿濃2%的紙漿，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉（Na2HPO4/NaH2PO4）緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 值為6.0，在45℃的恒溫水浴鍋中攪拌（轉(zhuǎn)速200 r/min），添加果膠酶預處理一段時間后，再添加漆酶和1%的谷氨酸（相對于絕干漿料）進行反應。反應結(jié)束后在沸水浴中滅活5 min。采用響應曲面法，利用Design Expert 軟件設(shè)計4 因素3 水平實驗確定最佳果膠酶用量、漆酶用量、果膠酶反應時間和漆酶反應時間。

1.4 抄紙及性能檢測

利用凱賽法自動抄紙器抄造定量80 g/m2的手抄片，然后在105℃下干燥10 min。將手抄片在恒溫恒濕實驗室（溫度（23±1）℃、相對濕度(50±2)%）放置12 h 后，分別按照GB/T 12914—2008、GB/T 454—2002、TAPPI T810om-98、TAPPI T414om-12 測定紙張的抗張強度、耐破度、環(huán)壓強度和撕裂度。

1.5 X射線光電子能譜儀（XPS）分析

利用凱賽法自動抄紙器抄造定量80 g/m2的手抄片，將紙樣放在干凈的金屬板表面上，于室溫下風干。剪下一小塊長寬不超過1 cm 的樣品附著在平坦的玻璃表面上，用XPS 檢測紙張表面C、O 元素的相對含量。測試條件：X 射線源采用鋁靶，工作電壓125 kV，電流20 mA，真空度3.1×107Pa。樣品數(shù)據(jù)從C 1s峰進行曲線擬合，線形為高斯線形。

1.6 原子力顯微鏡（AFM）分析

采用AFM 分析紙漿纖維表面。稱取約0.5 g 濕紙漿充分分散于200 mL 去離子水中，用膠頭滴管吸取少量紙漿懸浮液，滴在剛劈開的云母片一面上，云母片另一面用雙面膠粘于導電鐵片上，室溫風干后使用。每種紙漿做3個樣品，并確保每個樣品上有幾根分散且完整的纖維。使用原子力顯微鏡在空氣中采用輕敲模式成像。掃描速度為1.0 Hz，圖像分辨率為512×512 像素，同時記錄高度圖像和相位圖像，采用Nanoscope analysis 1.8軟件分析圖像。

1.7 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析

將絕干漿料樣品與預先干燥的KBr粉末混合在瑪瑙研磨機中研磨成粉末狀，在壓片模具中壓成全透明的薄片進行分析。掃描頻率范圍400～4000 cm-1，分辨率4 cm-1，信噪比30000∶1（峰/峰值）。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應面優(yōu)化分析

2.1.1 實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應曲面法對預處理OCC的工藝條件進行優(yōu)化。利用Design Expert軟件中的Box-Behnken模型，以果膠酶用量（A，2～4 U/g）、漆酶用量（B，11～13 U/g）、果膠酶處理時間（C，50～70 min）、漆酶處理時間（D，140～160 min）為影響因子，抗張強度（Y）為響應值，設(shè)計實驗方案，實驗因素水平表見表1，實驗方案和結(jié)果分析如表2～表3所示。

表1 實驗因素水平表Table 1 Table of experimental variables

表2 實驗方案和結(jié)果Table 2 Results of experimental design

2.1.2 響應曲面分析

在45℃、pH 值6.0、谷氨酸添加量1%（相對于絕干漿料）的條件下進行實驗，實驗結(jié)果用于多元回歸擬合[12]?？箯垙姸鹊亩A多項式回歸模型如式（1）所示。

表3 為回歸模型方差分析表。由表3 可知，回歸模型的F值（效應項與誤差項比值）為19.87，F(xiàn)值越大表示處理效果越明顯?；貧w模型的P值＜0.0001，表示回歸模型的回歸性好；且回歸模型相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9521，調(diào)整確定系數(shù)的平方R2Adj=0.9042，表示回歸模型擬合程度好，能夠解釋90%以上的響應值；失擬項P=0.6086＞0.05，無顯著性差異，說明回歸模型擬合度良好。因此，用該回歸模型可以對果膠酶協(xié)同漆酶/谷氨酸體系預處理OCC 的強度性能進行分析。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression model

圖1 顯示了回歸模型計算得出的抗張強度預測值與實驗中紙張抗張強度實際值之間的關(guān)系。從圖1 可以看出，實際值和預測值大部分分布在直線y=x上，說明該回歸模型的預測性能良好，進一步說明了回歸模型的有效性。以上分析表明該回歸模型可以較準確地說明各個變量和抗張強度之間的關(guān)系，同時可以對OCC 預處理的最佳條件進行較為精準地預測。

圖1 紙張抗張強度的預測值與實際值對比Fig.1 Comparison of observation and forecast of paper tensile strength

2.2 漆酶、果膠酶用量對紙張抗張強度的影響

圖2 為漆酶、果膠酶用量對紙張抗張強度影響的響應曲面圖。由圖2可知，在相同果膠酶用量下，隨著漆酶用量的增加，紙張抗張強度呈先增大后減小的趨勢。原因是因為漆酶去除了部分木素，促進了微細纖維的暴露，增大了纖維間的結(jié)合力，從而使紙張的抗張強度增大。同時氨基酸的加入增加了纖維的羧基含量[8]，羧基含量的增加可以提高纖維的潤脹性能和柔韌性。當漆酶用量增加到12.235 U/g 時，隨著漆酶用量繼續(xù)增加，紙張抗張強度呈現(xiàn)降低的趨勢，因為谷氨酸在漆酶的作用下通過邁克爾加成反應將羧基嫁接在纖維上，從而增加纖維的羧基含量，因此谷氨酸含量不變時，羧基含量不變，繼續(xù)增大漆酶用量對紙張強度的提升并未有明顯的作用，故漆酶最佳用量為12.235 U/g。在相同漆酶用量下，隨著果膠酶用量的增加，紙張強度呈先增大后減小的趨勢。果膠酶可以去除部分纖維表面的抽出物和木素，使纖維內(nèi)部的碳水化合物和木素暴露出來[10]，從而可以使漆酶更好地催化氧化木素，使細小纖維更好地暴露出來，促進纖維間的結(jié)合，表現(xiàn)為紙張抗張強度的增加。當果膠酶用量增加到3.508 U/g 時，繼續(xù)增大果膠酶用量，紙張抗張強度呈現(xiàn)降低的趨勢，過量的果膠酶加入會使纖維受到損傷，從而造成纖維強度降低，表現(xiàn)為紙張抗張強度降低，由此可以得出果膠酶最佳用量為3.508 U/g。

圖2 漆酶、果膠酶用量對紙張抗張強度影響的響應曲面圖Fig.2 Response surface of the effect of laccase dosage and pectinase dosage on the tensile strength of paper

2.3 酶預處理時間與酶用量對紙張抗張強度的影響

圖3 為果膠酶預處理時間與漆酶、果膠酶用量對紙張抗張強度的響應曲面圖。由圖3可知，隨著果膠酶預處理時間的增加，紙張抗張強度增加。當反應時間較短時，果膠酶對再生纖維的改性不充分，反應時間超過61.521 min 后，再延長反應時間，預處理效果不明顯，紙張抗張強度甚至表現(xiàn)出下降趨勢，果膠酶預處理時間過長可能會損傷纖維，從而降低紙張抗張強度。

圖3 果膠酶預處理時間與酶用量對紙張抗張強度影響的響應曲面圖Fig.3 Response surface of the effect of pectinase pretreatment time and enzyme dosage on tensile strength

圖4 為漆酶預處理時間與漆酶、果膠酶用量對紙張抗張強度的響應曲面圖。由圖4可以看出，漆酶預處理時間對紙張抗張強度的影響不太明顯，因為響應曲面分析選取的漆酶預處理時間是在單因素實驗的基礎(chǔ)上選取的，因此漆酶預處理時間已經(jīng)處于最優(yōu)值范圍內(nèi)，取模型預測值160 min為漆酶最佳預處理時間，由此可以得出最佳果膠酶預處理時間為61.521 min、最佳漆酶預處理時間為160 min。

圖4 漆酶預處理時間與酶用量對紙張抗張強度影響的響應曲面圖Fig.4 Response surface of the effect of laccase pretreatment time and enzyme dosage on tensile strength

2.4 最優(yōu)處理條件

通過Design Expert 軟件及實驗數(shù)據(jù)分析得出OCC預處理的最優(yōu)工藝條件為：果膠酶用量3.508 U/g、漆酶用量12.235 U/g、果膠酶預處理時間61.521 min，漆酶預處理時間160 min，結(jié)合實際操作考慮，最優(yōu)組采用果膠酶用量3.5 U/g、漆酶用量12.2 U/g、果膠酶預處理時間62 min，漆酶預處理時間160 min。通過回歸模型預測在此最優(yōu)處理條件下抄造紙張抗張強度為2.55 kN/m；在最優(yōu)條件下進行實驗，抄造紙張的實際抗張強度為2.27 kN/m，由于處理條件與模型預測的處理條件不完全一致，因此最優(yōu)條件下的實際紙張抗張強度值和預測抗張強度值有所偏差。

在最優(yōu)條件下對OCC 分別進行果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同預處理（P-Lac/Glu，果膠酶用量3.5 U/g、漆酶用量12.2 U/g、果膠酶預處理時間62 min，漆酶預處理時間160 min），單獨果膠酶預處理（Pectinase，果膠酶用量3.5 U/g，不添加漆酶和谷氨酸，其他反應條件與最優(yōu)組相同），單獨漆酶/谷氨酸預處理（Lac/Glu，漆酶用量12.2 U/g，不添加果膠酶，其他反應條件與最優(yōu)組相同），對照組（Control，不加任何試劑，其他處理條件和最優(yōu)組相同）。預處理后抄造紙張與對照組紙張的性能對比如表4所示。

由表4可知，與對照組相比，預處理OCC后抄造紙張的強度均得到了不同程度的提升，尤其在最優(yōu)條件下預處理抄造紙張的抗張強度、耐破度、撕裂度、環(huán)壓強度較對照組分別提高24.7%、33.7%、25.5%、31.1%，效果明顯好于二者單獨處理，這表明果膠酶與漆酶/谷氨酸具有協(xié)同效應。

表4 不同預處理條件下紙張性能對比Table 4 Comparison of paper properties under different pretreatments

2.5 XPS分析

對XPS 圖譜中的C 1s 峰進行分解，可分為4 個小峰，即C1、C2、C3 和C4。C1、C2、C3 和C4 的峰面積比即碳原子比。①C1 代表只和碳、氫連接的碳原子（—C—H、—C—C），來源于纖維表面的木素和抽提物；②C2 代表用σ鍵連有1 個氧原子的碳原子（—C—O），來源于纖維素分子中的各個碳原子和木素中羥基或醚鍵相連的碳；③C3代表連有2個非羰基氧或1 個羰基氧的碳原子（O—C—O 或C=O），主要來源于木素分子中的酮基、醛基或纖維素分子的氧化產(chǎn)物；④C4 代表連有1 個羰基氧和1 個非羰基氧的碳原子（O—C=O）。C1 反映纖維原料中非碳水化合物的含量，即木素和抽出物的含量，C2 和C3 反映碳水化合物的含量，C4 的含量小，在XPS 中一般很難檢測到。在纖維組分中，纖維素和半纖維素O原子含量多，抽出物和木素C 原子含量多，因此XPS 中O 原子的比例高代表纖維素的比例高，而木素和抽出物的比例小，O/C 比越高表示纖維表面暴露出的纖維素越多[13-14]。

圖5 為不同預處理條件下紙漿纖維的C 1s 分峰曲線圖，而各碳價態(tài)的變化情況如表5 所示。結(jié)合圖5 和表5 可知，與未預處理的OCC 漿料相比，預處理后的OCC 漿料纖維表面C1 含量有不同程度的降低，C2 和C3 含量有不同程度的增加，O/C 數(shù)值有不同程度的增加，最優(yōu)工藝條件下預處理OCC 漿料C1相對含量降低26.23%，C2 增加14.97%，C3 增加11.23%，O/C 增加27.88%。研究表明，碳價比可以反應纖維素、木素、抽出物的相對含量[15]。從O/C數(shù)值的增加，C1 含量的下降，C2、C3 含量的增加可以得知，經(jīng)預處理后的OCC 漿料纖維表面木素和抽出物含量減少，碳水化合物含量增加，進一步證實了所選生物酶體系預處理對纖維表面木素和抽出物的去除作用。碳水化合物增加表示纖維表面暴露了更多的親水性基團，纖維的吸水潤脹性能增強，有利于纖維的分絲帚化和纖維間的結(jié)合，解釋了預處理后OCC 成紙強度提升的原因。尤其是果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同體系預處理OCC 漿料后，各項指標達到最佳。

圖5 不同預處理條件下纖維的C 1s 峰分峰譜圖Fig.5 C 1s peaks of fibers under different pretreatment conditions

表5 不同預處理條件下OCC的O/C及C 1s峰分峰面積Table 5 O/C and C 1s peak areas of OCC under different pretreatment conditions

2.6 AFM分析

有研究表明，纖維的表面覆蓋一層非纖維物質(zhì)，即木素和抽出物，木素呈現(xiàn)不規(guī)則粒狀結(jié)構(gòu)，抽出物呈現(xiàn)類似球狀的結(jié)構(gòu)[16]。圖6 為不同預處理條件下OCC 漿料纖維表面的AFM 圖。由圖6 可知，未預處理OCC 漿料纖維表面被顆粒狀物質(zhì)包裹著，基本看不見特定走向的微細纖維，而經(jīng)過果膠酶、漆酶/谷氨酸、果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同預處理后的OCC 漿料纖維表面顆粒狀物質(zhì)均減少，特別是經(jīng)過果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同預處理后的OCC 漿料纖維表面微細纖維走向明顯。說明經(jīng)過酶預處理可以使微細纖維更好地暴露出來，有利于纖維的分絲帚化，有利于增加纖維間的結(jié)合能力，從而提高纖維成紙強度，這一結(jié)果與XPS結(jié)果一致。

圖6 不同預處理條件下纖維表面的AFM圖Fig.6 AFM images of fiber surface under different pretreatment conditions

2.7 FT-IR分析

紅外光譜分析采用基線法，1429 cm-1處左右為木素苯環(huán)骨架的伸縮振動吸收峰和碳水化合物—CH2變形振動吸收峰，其峰相對比較穩(wěn)定，分析以此峰作為基準數(shù)值表示其他峰的強度。圖7為不同預處理條件下OCC 漿的FT-IR 圖。表6 為不同預處理條件下OCC漿纖維吸收峰的相對吸收強度。3349～3406 cm-1處為分子間氫鍵—OH 拉伸的吸收峰，從圖7 和表6可以看出，與對照組相比，不同酶預處理后的OCC漿特征峰相對強度有不同程度的增加。這可能是由于不同酶預處理OCC 漿纖維后，纖維中的木素逐漸降解，進而產(chǎn)生更多的羥基，增強了纖維間的結(jié)合力，也可以解釋預處理后的OCC 漿料有更好的物理性質(zhì)。1373～1375 cm-1處是木素芳羥基O—H 變形振動和纖維素/半纖維素聚糖或脂肪族C—H彎曲振動，經(jīng)過不同酶預處理后，紙漿在該處的吸收峰強度均增加，表明酶預處理會部分去除紙漿中含有的木素，提高碳水化合物的相對含量，和上述結(jié)論一致，果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同預處理的效果最好。

表6 不同預處理條件下FT-IR光譜中峰的吸收強度[16]Table 6 Absorption intensities of peaks in FT-IR spectra under different pretreatment conditions[16]

圖7 不同預處理條件下OCC漿的FT-IR譜圖Fig.7 FT-IR spectra of OCC pulp under different pretreatment conditions

3 結(jié)論

本研究采用果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同預處理廢舊瓦楞箱紙板（OCC），采用響應曲面法優(yōu)化工藝條件，探討果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同預處理OCC 后抄造紙張的強度性能。

3.1 OCC 預處理的最優(yōu)工藝條件為：果膠酶用量3.5 U/g，漆酶用量12.2 U/g，果膠酶預處理時間62 min、漆酶預處理時間160 min。

3.2 與未預處理OCC 抄造的空白紙張相比，在最優(yōu)工藝條件下預處理OCC 抄造的紙張抗張強度提高24.7%，耐破度提高33.7%，撕裂度提高25.5%，環(huán)壓強度提高31.1%。

3.3 X 射線光電子能譜儀（XPS）分析表明，與未預處理OCC 漿料相比，在最優(yōu)工藝條件下預處理OCC 漿料的C1 相對含量降低26.2%，C2 相對含量增加15.0%，C3 相對含量增加11.2%，O/C 增加27.9%，表明纖維表面碳水化合物的相對含量增加，纖維表面暴露了更多的親水性基團，纖維的吸水潤脹性能增強，有利于纖維的分絲帚化和纖維間的結(jié)合。

3.4 通過原子力顯微鏡（AFM）對纖維形貌進行分析，輔助證明了XPS的分析結(jié)果，可以看出經(jīng)過酶預處理后暴露出更多的微細纖維，更有利于纖維間的結(jié)合，提高纖維的強度；紅外光譜表明，經(jīng)過果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同預處理后，分子間氫鍵—OH 拉伸的吸收峰、木素芳羥基O—H變形振動和纖維素/半纖維素聚糖C—H 彎曲振動吸收峰強度增加，表明酶預處理會部分去除紙漿中含有的木素，提高碳水化合物的相對含量。

3.5 果膠酶和漆酶/谷氨酸協(xié)同預處理OCC比果膠酶和漆酶/谷氨酸單獨預處理對抄造紙張強度性能提升的幅度更高，表明果膠酶和漆酶/谷氨酸具有協(xié)同效應。