不同青稞品種對(duì)7.5%啶磺草胺的耐藥性分析

張宇翔，朱 亮，魏有海*

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016；3.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016； 4.湖北省十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/農(nóng)技中心，湖北 十堰 442000)

在青藏高原傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，青稞一直都是優(yōu)勢(shì)作物和重要的糧食作物，目前，青稞正從一個(gè)地區(qū)性口糧作物的形象逐漸向國(guó)際性保健食品的形象轉(zhuǎn)變[1-2]。2019年統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示青海省內(nèi)的青稞播種面積已經(jīng)達(dá)到6.385×104hm2，占青海省糧食播種總面積的22.79%；青稞產(chǎn)量144.10×104kg，占青海省糧食總產(chǎn)量的13.65%[3]。

農(nóng)田雜草對(duì)耕作及防除措施適應(yīng)力極強(qiáng)，青海青稞田雜草危害率達(dá)83.7%，是影響青稞產(chǎn)量提高、品質(zhì)提升的重要限制因素[4-5]。近年來(lái)，由于青稞栽培技術(shù)的改變和農(nóng)業(yè)機(jī)械跨區(qū)作業(yè)，致使原來(lái)只在青海東部農(nóng)業(yè)區(qū)零星發(fā)生的旱雀麥，在青稞田迅速蔓延擴(kuò)散，成為新的惡性難治雜草。在門源縣腦山生態(tài)區(qū)，旱雀麥平均密度達(dá)23株/m2[6]。青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院雜草課題組引進(jìn)小麥田除草劑7.5%啶磺草胺水分散粒劑(WG)用于青稞田防除旱雀麥，取得了良好效果。但農(nóng)田雜草與作物之間、不同種類作物之間和相同作物的不同品種之間對(duì)除草劑的耐藥性均有較大差異[7]。蘇少泉[8]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，植物對(duì)除草劑產(chǎn)生的耐藥性差異與該除草劑作用的靶標(biāo)和植物體內(nèi)代謝酶活性密切相關(guān)；董雪等[9]、李亞?wèn)|等[10]通過(guò)試驗(yàn)證明在啶磺草胺作用下，不同小麥品種對(duì)其均有明顯的耐藥性差異。但目前關(guān)于不同青稞品種在7.5%啶磺草胺作用時(shí)是否具有耐藥性差異及耐藥性產(chǎn)生原因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。面對(duì)旱雀麥危害日益嚴(yán)重、除草劑品種匱乏的生產(chǎn)實(shí)際，本研究收集了青海不同地區(qū)的10個(gè)青稞主栽品種，對(duì)7.5%啶磺草胺的耐藥性水平進(jìn)行測(cè)定，并測(cè)定了施藥后不同時(shí)期靶標(biāo)酶(ALS)和代謝酶(GSTs)的活性，探討了青稞品種對(duì)除草劑產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理，為科學(xué)評(píng)價(jià)不同青稞品種對(duì)7.5%啶磺草胺的耐藥性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

(1)供試青稞品種。柴青1號(hào)、北青1號(hào)、北青2號(hào)、北青3號(hào)、北青4號(hào)、北青5號(hào)、北青6號(hào)、北青8號(hào)、昆侖14號(hào)、昆侖15號(hào)，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物研究所提供，均為青海不同地區(qū)的青稞主栽品種。

(2)供試除草劑。7.5%啶磺草胺水分散粒劑(WG)，由陶氏益農(nóng)(中國(guó))有限公司生產(chǎn)。

(3)供試化學(xué)試劑。90%黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、99%2，4-二硝基氯苯(CDNB)、97%硫胺素焦磷酸(TPP)、99%肌酸、99%α-萘酚、99%考馬斯亮藍(lán)G-250、98%牛血清蛋白(BSA)、95%還原型谷胱甘(GSH)、99%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Tris、3-羥基丁酮、丙酮、丙酮酸鈉、MgCl2、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、95%乙醇、85%磷酸、37.5%鹽酸、98%濃硫酸，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)、 3WPSH-50D型生測(cè)噴霧塔(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所)、高速冷凍離心機(jī)(ST 16R)、制冰機(jī)、恒溫水浴鍋、FA1104-B萬(wàn)分之一分析天平。

1.3 不同青稞品種對(duì)7.5%啶磺草胺的耐藥性測(cè)定

本試驗(yàn)在青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院溫室進(jìn)行，采用盆栽法，以體積比2∶1，將砂土和營(yíng)養(yǎng)土攪拌并混合均勻后裝入花盆中(直徑10 cm，深8 cm)，每盆播撒20粒青稞種子后覆土3 cm，放入不銹鋼盤中，定時(shí)定量澆水，待其長(zhǎng)至3葉期開(kāi)始間苗，每盆保留10株長(zhǎng)勢(shì)一致的青稞幼苗備用。

試驗(yàn)設(shè)7.5%啶磺草胺施用劑量分別為3.125、6.25、12.5、25、37.5、50、100 g/hm2，共7個(gè)處理。根據(jù)施用劑量準(zhǔn)確稱量除草劑后兌水24 mL，使用生測(cè)噴霧塔在青稞3葉期從低到高濃度依次噴霧，每個(gè)劑量施藥后清洗噴霧塔再進(jìn)行下一個(gè)濃度噴霧，并設(shè)噴施等量清水為對(duì)照，重復(fù)4次。

施藥后，每天觀察各處理青稞的長(zhǎng)勢(shì)、葉色等。施藥后14 d測(cè)定株高、地上部鮮重，計(jì)算各處理的株高抑制率、鮮重抑制率，以抑制率機(jī)率值(Y)和濃度對(duì)數(shù)值(X)建立回歸方程(Y=a+bX)，計(jì)算青稞幼苗的IC50值、耐藥性倍數(shù)。

1.4 7.5%啶磺草胺對(duì)青稞ALS活力的影響

(1)酶液的提取。在預(yù)冷的研缽中加入1.0 g剪碎的青稞葉片(3葉期)，加入酶提取液4 mL(含有1 mmol/L 丙酮酸鈉、0.5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L TPP、1.0 μmol/L FAD的磷酸緩沖液)，迅速研磨成勻漿并轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，再用4 mL酶提取液沖洗研缽并轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃冰箱冷藏10min。于4 ℃、25 000 r/min下離心20 min，取上清液作為粗酶液，向粗酶液緩慢加入硫酸銨晶體至50%飽和度，沉淀2 h 后，4 ℃、25 000 r/min離心30 min，去除上清液，將沉淀用6 mL酶溶解液溶解后待測(cè)。

(2)酶活性測(cè)定。待青稞幼苗長(zhǎng)至3葉期，以7.5%啶磺草胺田間推薦最低量和最高量(12.5 g/hm2和37.5 g/hm2)對(duì)莖葉進(jìn)行噴霧處理，設(shè)噴施清水為對(duì)照，處理完畢后移入溫室，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。分別于施藥后第1、3、5、7、9、11、13天采集施藥和空白對(duì)照青稞植株地上部分葉片1.0 g，共采集7次，每次重復(fù)4次。參考范志金等[11]的試驗(yàn)方法進(jìn)行ALS活力測(cè)定?？扇苄缘鞍缀繙y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[12]。設(shè)處理組酶活力與對(duì)照組酶活力的比值為ALS相對(duì)活力。

1.5 7.5%啶磺草胺對(duì)青稞GSTs活力的影響

(1)酶液提取。取青稞3葉期葉片1.0 g，剪碎后放入預(yù)冷的研缽中，加入8 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0，含25 mmol/L還原型谷胱甘肽及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的PVP)研磨成勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液12 000 r/min離心5 min，取上清液做酶液，于4 ℃下保存，待測(cè)。

(2)酶活性測(cè)定。待青稞幼苗長(zhǎng)至3葉期，以7.5%啶磺草胺田間推薦劑量12.5 g/hm2和37.5 g/hm2對(duì)莖葉進(jìn)行噴霧處理，以噴清水為對(duì)照，處理完畢后移入溫室，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。分別于施藥后第1、3、5、7、9、11、13天采集施藥和空白對(duì)照青稞植株地上部分1.0 g，共采集7次，每次重復(fù)4次?；钚詼y(cè)定在10 mL具塞試管中加入3 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)和0.1 mL酶反應(yīng)液，每管重復(fù)3次，于25 ℃保溫10 min，加入0.1 mL濃度為13 mmol/L的CDNB溶液，反應(yīng)10 min，采用紫外分光光度計(jì)于340 nm處測(cè)OD值，并作為酶活力單位。設(shè)處理 OD值與同期對(duì)照OD值的比值為GSTs相對(duì)活力。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0進(jìn)行分析處理，用Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同青稞品種對(duì)7.5%啶磺草胺的耐藥性測(cè)定

耐藥性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，北青8號(hào)、北青4號(hào)、北青6號(hào)、昆侖14號(hào)、北青3號(hào)、柴青1號(hào)、北青1號(hào)、昆侖15號(hào)、北青5號(hào)、北青2號(hào)的IC50值依次為22.376、20.379、17.516、13.573、12.323、10.374、9.526、7.731、7.197、5.504 g/hm2，其中北青8號(hào)耐藥性最強(qiáng)，北青2號(hào)最為敏感。以IC50值最低的北青2號(hào)為敏感性品種，各青稞品種的耐藥性倍數(shù)依次為4.065、3.703、3.182、2.466、2.239、1.885、1.731、1.405、1.402、1.000。因此，選擇耐藥性最強(qiáng)的北青8號(hào)和耐藥性最弱的北青2號(hào)，進(jìn)一步測(cè)定施用不同濃度7.5%啶磺草胺后，兩個(gè)青稞品種體內(nèi)ALS和GSTs活力差異。

表1 不同青稞品種對(duì)啶磺草胺的耐藥性差異

2.2 7.5%啶磺草胺對(duì)兩個(gè)青稞品種ALS活力的影響

未施藥的兩個(gè)青稞品種ALS活力變化見(jiàn)圖1。同一時(shí)間下未施藥的北青8號(hào)與北青2號(hào)的ALS活力沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異，并且隨著時(shí)間變化，兩個(gè)青稞品種的ALS活力變化不明顯，為2.356～2.721 nmol/(h·mg)。不同濃度7.5%啶磺草胺對(duì)兩個(gè)青稞品種ALS相對(duì)活力影響如圖2所示。施藥后兩個(gè)青稞品種ALS相對(duì)活力均受到明顯抑制，施藥后第1天受抑制最顯著(ALS相對(duì)活力最低)，隨后逐漸恢復(fù)至對(duì)照水平。7.5%啶磺草胺濃度為12.5 g/hm2時(shí)，北青8號(hào)的ALS相對(duì)活力在第5天恢復(fù)至1.160，北青2號(hào)在第7天恢復(fù)至1.000。當(dāng)7.5%啶磺草胺濃度為37.5 g/hm2時(shí)，北青8號(hào)的ALS相對(duì)活力在第7天恢復(fù)至0.968，而北青2號(hào)ALS相對(duì)活力最高僅恢復(fù)為0.763。說(shuō)明不同青稞品種間耐藥性差異產(chǎn)生的原因與不同青稞品種ALS對(duì)7.5%啶磺草胺敏感性強(qiáng)弱有關(guān)，在青稞田間施用7.5%啶磺草胺時(shí)濃度的安全劑量為12.5 g/hm2。

圖1 未施藥處理兩個(gè)青稞品種ALS活力Fig.1 ALS activity of two varieties of Hordeum vulgare var nudumwithout applying drugs

圖2 不同濃度7.5%啶磺草胺對(duì)兩個(gè)青稞品種ALS相對(duì)活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of 7.5% pyroxsulam on ALS relative activity of two Hordeum vulgare var nudum varieties

2.3 7.5%啶磺草胺對(duì)兩個(gè)青稞品種GSTs活力的影響

未施藥兩個(gè)青稞品種的GSTs活力見(jiàn)圖3。兩個(gè)青稞品種的GSTs活力變化均不明顯，且二者的GSTs活力差異不顯著。不同濃度7.5%啶磺草胺對(duì)兩個(gè)青稞品種GSTs相對(duì)活力影響如圖4所示。兩個(gè)青稞品種在不同濃度除草劑處理后，GSTs相對(duì)活力均有明顯變化且反應(yīng)迅速。在12.5 g/hm2和37.5 g/hm2濃度除草劑處理后第1天，北青2號(hào)GSTs相對(duì)活力分別為1.402和1.249，北青8號(hào)GSTs相對(duì)活力分別為1.278和1.218，施藥后第3天，兩個(gè)青稞品種的GSTs相對(duì)活力均達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下降，第9天基本恢復(fù)至對(duì)照水平。在兩個(gè)濃度7.5%啶磺草胺作用下，施藥后第3天，北青8號(hào)的GSTs相對(duì)活力分別為1.626和1.586，北青2號(hào)的GSTs相對(duì)活力分別為1.456和1.324。北青8號(hào)在兩個(gè)濃度除草劑作用下GSTs相對(duì)活力達(dá)到峰值時(shí)變化幅度小于北青2號(hào)，說(shuō)明北青8號(hào)GSTs相對(duì)活力大于北青2號(hào)。在不同濃度7.5%啶磺草胺作用下兩個(gè)青稞品種GSTs活力均表現(xiàn)出一樣的變化趨勢(shì)，但北青8號(hào)的峰值變化幅度小于北青2號(hào)，整體GSTs相對(duì)活力大于北青2號(hào)。由此可知，北青8號(hào)體內(nèi)GSTs反應(yīng)更迅速、解毒能力更強(qiáng)，也說(shuō)明不同青稞品種對(duì)7.5%啶磺草胺產(chǎn)生耐藥性差異的原因與不同青稞品種體內(nèi)GSTs活力有關(guān)。

圖3 未施藥處理兩個(gè)青稞品種GSTs活力Fig.3 GSTs activity of two varieties of Hordeum vulgare var nudumwithout applying drugs

圖4 不同濃度7.5%啶磺草胺對(duì)兩個(gè)青稞品種GSTs相對(duì)活力的影響Fig.4 Effects of 7.5% pyroxsulam with different concentrations on GSTs relative activity of twoHordeum vulgare var nudum varieties

3 討論與結(jié)論

青稞作為青藏高原最具地域特色的糧食作物，由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)及較強(qiáng)的抗逆性，成為西藏及青海牧民的主食[13]。本研究明確了青海不同地區(qū)的青稞主栽品種對(duì)7.5%啶磺草胺的敏感性，不同青稞品種對(duì)該除草劑耐藥性具有較大差異。在供試的10個(gè)青稞主栽品種中，北青2號(hào)的耐藥性最弱，其耐藥性倍數(shù)為1；北青8號(hào)耐藥性最強(qiáng)，其耐藥性倍數(shù)為4.065。李亞?wèn)|等[10]的研究也證實(shí)不同的小麥品種對(duì)啶磺草胺的耐藥性具有較大差異。

ALS是支鏈氨基酸合成通路中的第一個(gè)酶，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中扮演重要角色，可合成纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸[14]。本研究結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件(未施藥)下，北青8號(hào)(耐藥性)和北青2號(hào)(敏感性)品種體內(nèi)的ALS活力在不同時(shí)間段內(nèi)均無(wú)顯著差異，這說(shuō)明正常生長(zhǎng)條件下兩個(gè)青稞品種的ALS表達(dá)并不存在差異。在12.5 g/hm2的7.5%啶磺草胺處理下，兩個(gè)青稞品種的ALS活力均顯著下降，但在施藥后第5天，北青8號(hào)率先恢復(fù)到較高水平，而北青2號(hào)在施藥后第13天才恢復(fù)到較高水平，說(shuō)明北青8號(hào)比北青2號(hào)能更快應(yīng)對(duì)7.5%啶磺草胺的脅迫;當(dāng)施用濃度增大到37.5 g/hm2時(shí)，盡管兩個(gè)青稞品種的ALS活力均出現(xiàn)顯著下降，但在同一時(shí)間北青8號(hào)始終高于北青2號(hào)，此結(jié)果與張建樹(shù)等[15]研究發(fā)現(xiàn)ALS對(duì)除草劑的敏感性降低，可能是由于目標(biāo)植物的ALS對(duì)抑制劑產(chǎn)生抗性這一結(jié)論相同。當(dāng)除草劑濃度為37.5 g/hm2時(shí)，這兩個(gè)青稞品種的ALS活力上升幅度一直很小，說(shuō)明當(dāng)該藥達(dá)到這個(gè)濃度時(shí)，對(duì)耐藥性青稞品種和敏感性青稞品種都產(chǎn)生了極度損傷。因此在青稞田應(yīng)用該藥推薦劑量不超過(guò)12.5 g/hm2，這與李亞?wèn)|等[10]在小麥田使用啶磺草胺推薦劑量不超過(guò)13.5 g/hm2的結(jié)果相符。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)屬于抗氧化酶家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及壓力應(yīng)激中起著至關(guān)重要的作用[16]。李如男等[17]研究表明，GSTs參與農(nóng)藥在植物體內(nèi)的II相代謝，將農(nóng)藥變?yōu)楸饶阁w的水溶性更強(qiáng)的物質(zhì)，使植物毒性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常生長(zhǎng)條件(未施藥)下，兩個(gè)青稞品種體內(nèi)的GSTs活力在不同時(shí)間段內(nèi)均無(wú)顯著差異，說(shuō)明該酶在不同品種間的表達(dá)無(wú)差異。在12.5 g/hm27.5%啶磺草胺脅迫下，施藥后3 d北青8號(hào)的GSTs活力迅速達(dá)到峰值，且之后時(shí)間段的活力一直高于北青2號(hào)，說(shuō)明在該除草劑的“壓力”下，北青8號(hào)應(yīng)對(duì)更為迅速。而在該藥濃度為37.5 g/hm2條件下，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)北青8號(hào)的GSTs活力均高于北青2號(hào)，因此推測(cè)在 7.5%啶磺草胺脅迫下，耐藥性品種體內(nèi)GSTs的迅速過(guò)表達(dá)是其產(chǎn)生耐藥性的原因之一。Kim等[18]研究表明，轉(zhuǎn)入GSTs基因的煙草過(guò)表達(dá)后對(duì)草丁磷的抗性明顯增強(qiáng)，與本文研究結(jié)果相符。本研究篩選出了對(duì)7.5%啶磺草胺具有耐藥性的青稞品種，明確了適宜的施藥劑量，探究了抗性產(chǎn)生的原因。