Box–Behnken優(yōu)化馬齒莧抗氧化澄清飲料制備工藝

陳凌，駱盧佳，余蕾

Box–Behnken優(yōu)化馬齒莧抗氧化澄清飲料制備工藝

陳凌1，駱盧佳1，余蕾2

（1.嘉興職業(yè)技術學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)學院，浙江 嘉興 314036；2.浙江德馨飲料有限公司，浙江 嘉興 314000）

比較干、鮮馬齒莧的活性成分及對1,1–二苯基–2–三硝基苯肼（DPPH）的清除率，選擇抗氧化活性高的馬齒莧酶解液為功能原料，優(yōu)化馬齒莧抗氧化飲料的配方。以馬齒莧酶解液、甜菊糖苷、檸檬酸為自變量，以飲料的感官評分為響應值，采用Box–Behnken響應面法優(yōu)化馬齒莧抗氧化澄清飲料的制備工藝。鮮馬齒莧酶解液中多糖和黃酮的含量高于干馬齒莧，對DPPH的清除率也大于干馬齒莧。在鮮馬齒莧酶解液的體積分數(shù)為45.2%、甜菊糖苷的質(zhì)量濃度為0.23 g/L、檸檬酸的質(zhì)量濃度為0.06 g/L等條件下，馬齒莧飲料的理論感官評分值為33.2，實際評分值為33.3，表明其抗氧化能力較好（飲料的體積為0.60 mL時對DPPH的清除率為34.6%）?；貧w模型的預測值與實測值接近，采用響應面法優(yōu)化馬齒莧抗氧化飲料的工藝合理可行，制備的馬齒莧抗氧化飲料呈現(xiàn)酒紅色、澄清透明、酸甜適宜。

Box–Behnken設計；馬齒莧；澄清飲料；抗氧化

馬齒莧（L）屬馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本植物，是國家衛(wèi)生和計劃生育委員會認定的藥食同源野生植物，它含人體所需的18種氨基酸、多種微量元素及維生素，含有生物堿、香豆精類、黃酮類、多糖、強心甙、蒽醌甙、左旋去甲腎上腺素、多巴明及多巴等[1-2]，還含有以前認為只存在于海產(chǎn)品中的ω–3脂肪酸。ω–3脂肪酸能使血液黏度下降，促使血管擴張，對心臟病的防治起著積極作用。馬齒莧中的黃酮、多糖等活性物質(zhì)具有良好的清除自由基、抗氧化、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫機能、抗腫瘤等多種藥理功能[3-6]。馬齒莧具有治療、調(diào)節(jié)、營養(yǎng)三大功能。目前，有關馬齒莧飲料的報道主要以干制馬齒莧為原料[7-8]，未見以新鮮馬齒莧為原料制備飲料的相關研究。

文中以抗氧化活性高的馬齒莧酶解液、甜菊糖苷（被國際上譽為“世界第三糖源”，是一種甜度高、熱能低的純天然甜味劑[9]）、檸檬酸為單因素，以對飲料的感官評分為響應值，采用Box–Behnken設計優(yōu)化馬齒莧抗氧化澄清飲料的工藝配方，為馬齒莧產(chǎn)品的進一步深加工和開發(fā)提供參考。

1 實驗

1.1 材料

主要材料：馬齒莧（地上部分），于2019年8月采自嘉興職業(yè)技術學院校園內(nèi)；甜菊糖苷、檸檬酸，均為食品級，河南旗諾食品配料有限公司；酒精、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純，上海聯(lián)試化工試劑有限公司；蘆丁分析純，國藥集團化學試劑有限公司；果膠酶（酶活力≥50.0 U/g），國藥集團化學試劑有限公司；DPPH，東京化成工業(yè)株式會社；維生素C，天津博迪化工股份有限公司。

主要儀器：DK–S24型恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；UV–1800PC紫外可見分光光度計，上海色譜儀器有限公司；ATY224分析天平，日本島津公司；CR21N高速冷凍離心機，日本日立公司；R–210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，瑞士步琪公司；JYZ–E6原汁機，九陽股份有限公司；Millipore超純水儀、Smartpark DQ3純水柱，美國默克密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 干鮮馬齒莧酶解液抗氧化性的比較

1.2.1.1 干鮮馬齒莧酶解液的提取

將同時在同地采摘的馬齒莧分為質(zhì)量相等的2份，一份干制后按“Box–Behnken中心組合設計優(yōu)化酶法提取馬齒莧多糖的工藝”[10]提??；另一份將其鮮榨后，按“響應面法優(yōu)化馬齒莧多糖酶法提取工藝”[11]提取，然后比較干鮮馬齒莧酶解液的抗氧化成分（主要是多糖和黃酮）的含量和抗氧化活性。

1.2.1.2 抗氧化成分的測定

干鮮馬齒莧酶解液按1.2.1.1方法提取，將提取液在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入4 倍體積的無水乙醇后進行醇沉，然后置于4 ℃冰箱中，放置24 h后置于冷凍離心機中離心（10 000 r/min，8 min），將沉淀物質(zhì)在60 ℃下干燥，至質(zhì)量恒定，即得馬齒莧粗多糖。采用苯酚–硫酸法測定馬齒莧酶解液中多糖的含量，采用NaNO2–Al(NO3)3法測定馬齒莧酶解液中總黃酮的含量[12]。

1.2.1.3 抗氧化性的測定

采用分光光度法測定DPPH自由基的清除率[9]，清除率越大其抗氧化性越強。

1.2.2 工藝流程

工藝流程：新鮮馬齒莧→殺青→榨漿→酶解→過濾→調(diào)配→混合→灌裝→殺菌→冷卻→成品。

操作要點：原料預處理，選擇無腐爛、無病蟲、無損傷的新鮮馬齒莧，用自來水清洗干凈，再用純凈水過1遍，瀝干水分后備用；殺青，采用蒸汽殺青（5 min）鈍化多酚類氧化酶的活性[13]，盡可能多地保存馬齒莧中的抗氧化物質(zhì)，去除馬齒莧中的青草氣味，為飲料品質(zhì)和下一步工序奠定基礎；榨漿，采用螺旋榨汁機，在壓榨過程中防止或減輕空氣的混入，避免損害馬齒莧汁的色、香、味；酶解，用超純水按一定的漿液比在50 ℃下用果膠酶酶解后，加熱至100 ℃，保持5 min，使得酶失活，再用8層紗布過濾后得到酶解液，并將其保存于4 ℃冰箱里備用；調(diào)配，以馬齒莧酶解液、甜菊糖苷、檸檬酸為單因素，以飲料的感官品質(zhì)為響應值，采用響應面法優(yōu)化工藝，得到最佳配方；灌裝，將調(diào)配好的馬齒莧飲料灌入瓶中，將瓶封口后，迅速在沸水浴中殺菌2 min。

1.2.3 感官評價

感官評價指標見表1，選擇10名食品專業(yè)人員從飲料的色澤、風味、滋味和外觀形態(tài)等4個方面進行感官評價，取其平均值作為最終結果。

1.2.4 單因素試驗

固定檸檬酸添加量（質(zhì)量濃度）為0.06 g/L、甜菊糖苷添加量（質(zhì)量濃度）為0.20 g/L，在馬齒莧酶解液添加量（體積分數(shù)）分別為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%時，研究馬齒莧酶解液對飲料感官品質(zhì)的影響。固定馬齒莧酶解液添加量（體積分數(shù)）為45%、檸檬酸的質(zhì)量濃度為0.06 g/L，在甜菊糖苷添加量（質(zhì)量濃度）分別為0、0.05、010、0.15、0.20、0.25 g/L時，研究甜菊糖苷對飲料感官品質(zhì)的影響。固定馬齒莧添加量（體積分數(shù)）為45%、甜菊糖苷的質(zhì)量濃度為0.20 g/L，在檸檬酸添加量（質(zhì)量濃度）分別為0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 g/L時，研究檸檬酸對飲料感官品質(zhì)的影響。

表1 馬齒莧飲料感官評分標準

Tab.1 Sensory scoring criteria of Portulaca oleracea L. beverage

1.2.5 Box–Bnhnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以抗氧化性高的馬齒莧酶解液、甜菊糖苷、檸檬酸添加量為自變量，以飲料的感官評價為響應值，采用Box–Behnken 設計響應面試驗，具體因素和水平見表2。

表2 響應面分析因素與水平

Tab.2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用OriginPro 9.0 軟件作圖，采用Design Expert 8.0.6 軟件的Box–Behnken進行試驗設計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 干鮮馬齒莧酶解液抗氧化活性比較

由實驗測得干馬齒莧粗多糖的得率為4.88 g/kg（鮮計），鮮馬齒莧粗多糖的得率為12.51 g/kg（鮮計）；干馬齒莧酶解液中黃酮的得率為2.38 g/kg（鮮計），鮮馬齒莧酶解液中黃酮的得率為5.45 g/kg（鮮計）。顯然，鮮馬齒莧酶解液中的活性成分含量遠高于干馬齒莧酶解液。

將干鮮馬齒莧（鮮質(zhì)量相同）酶解液稀釋到相同體積后對DPPH的清除率見圖1。由圖1可知，不同體積的干鮮馬齒莧酶解液對DPPH自由基均有清除作用，且隨著酶解液體積的增加而增加，鮮馬齒莧酶解液的抗氧化性強于干馬齒莧酶解液。鮮馬齒莧酶解液中黃酮的含量高于干馬齒莧酶解液，這與陳莉萍等[14]的研究相符。研究還表明，鮮馬齒莧對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌的抗菌效果均優(yōu)于干馬齒莧。由此，選用鮮馬齒莧酶解液來配制馬齒莧抗氧化澄清飲料，以下均采用鮮馬齒莧酶解液進行響應面優(yōu)化試驗。

圖1 干鮮馬齒莧酶解液對DPPH的清除能力

2.2 單因素試驗

2.2.1 馬齒莧酶解液體積分數(shù)對飲料感官品質(zhì)的影響

從圖2可知，隨著馬齒莧酶解液體積分數(shù)的增加，澄清飲料的感官評分呈先增后降的趨勢；當馬齒莧酶解液的體積分數(shù)為45%時，飲料的感官評分相對最高，此時溶液呈亮紅色，馬齒莧特有的氣味突出；當馬齒莧酶解液體積分數(shù)繼續(xù)增大時，溶液顏色會加深（粉紅色的馬齒莧酶解液遇到光后顏色會逐漸加深，這是由于光是花色苷生物合成的重要因子[15]），而馬齒莧的酸味和澀味會加重，所以飲料的感官品質(zhì)就會下降。由此，將馬齒莧酶解液的體積分數(shù)確定為45%。

圖2 馬齒莧酶解液的體積分數(shù)對飲料感官品質(zhì)的影響

2.2.2 甜菊糖苷質(zhì)量濃度對飲料感官品質(zhì)的影響

由圖3可知，在飲料中添加甜菊糖苷有利于調(diào)整其口感，甜菊糖苷的質(zhì)量濃度為0.2 g/L時，飲料的酸甜比相對最佳；在甜菊糖苷的質(zhì)量濃度小于0.2 g/L時，飲料酸味偏重；在甜菊糖苷的質(zhì)量濃度大于0.2 g/L時，甜度偏大，并且掩蓋了馬齒莧特有的味道。由此，將甜菊糖苷的質(zhì)量濃度確定為0.2 g/L。

圖3 甜菊糖苷的質(zhì)量濃度對飲料感官品質(zhì)的影響

2.2.3 檸檬酸質(zhì)量濃度對飲料感官品質(zhì)的影響

從圖4 看出，當檸檬酸的質(zhì)量濃度為0.06 g/L時，澄清飲料酸甜適宜；當檸檬酸的質(zhì)量濃度大于0.06 g/L，飲料的酸度偏高；當檸檬酸的質(zhì)量濃度小于0.06 g/L，飲料的甜度增高，影響了飲料的口感。由此，將檸檬酸的質(zhì)量濃度確定為 0.06 g/L。

圖4 檸檬酸的質(zhì)量濃度對飲料感官品質(zhì)的影響

2.3 響應面法優(yōu)化馬齒莧抗氧化飲料配方

通過Box–Behnken進行試驗設計，對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，并對模型進行方差分析，分析結果見表4。

從表4可知，該模型顯著（=0.010 4<0.05），失擬項不顯著（=0.141>0.05），這說明該模型的擬合度較好，能較好地反映各因素與響應值的變化關系，可預測馬齒莧抗氧化澄清飲料最佳組合的實際情況。值表明，各因素對馬齒莧抗氧化飲料品質(zhì)由大到小的影響順序為甜菊糖苷質(zhì)量濃度（）、檸檬酸質(zhì)量濃度（）、馬齒莧酶解液體積分數(shù)（）。根據(jù)回歸方程做出響應面圖，響應曲面越陡峭則交互作用越強。等高線的形狀可反映交互效應的強弱，橢圓形表示2個因素的交互作用顯著, 而圓形則與之相反。由圖5—7可知，交互影響顯著，得到馬齒莧抗氧化飲料的二次回歸方程為：=33.07+ 0.24+0.47?0.31?0.25+0.42+0.05?0.6?0.42?0.95。

2.4 驗證試驗

依據(jù)回歸模型的數(shù)學分析，確定了馬齒莧抗氧化澄清飲料的最佳配方：馬齒莧酶解液的體積分數(shù)45.2%、甜菊糖苷的質(zhì)量濃度0.23 g/L、檸檬酸的質(zhì)量濃度0.06 g/L，感官評價預測值為33.2分。按此配方做3次平行驗證試驗，感官評分的平均值為33.3分，非常接近預測值，這說明該模型穩(wěn)定可靠。

該配方飲料的抗氧化性能見圖8。從圖8可知，隨著飲料添加量的增加對DPPH的清除率增大，即抗氧化性增加；當飲料的體積為0.60 mL時，對DPPH的清除率為34.6%。

表3 Box–Behnken設計方案及結果

Tab.3 Experimental design and results for Box-Behnken

表4 回歸模型方差分析結果

Tab.4 Analysis of variance for the fitted regression model

注：*<0.05，差異顯著；**<0.01，差異極顯著。

圖5 馬齒莧酶解液和甜菊糖苷的含量對感官品質(zhì)的影響

圖6 馬齒莧酶解液和檸檬酸的含量對感官品質(zhì)的影響

圖7 甜菊糖苷和檸檬酸的含量對感官品質(zhì)的影響

圖8 馬齒莧飲料對DPPH的清除率

3 結語

鮮馬齒莧酶解液的活性成分（主要是多糖和黃酮）含量高于干馬齒莧酶解液，其抗氧化性也強于干馬齒莧酶解液，因此選用鮮馬齒莧酶解液來配制馬齒莧抗氧化飲料。

以鮮馬齒莧酶解液為原料，用Box–Bohnken試驗設計優(yōu)化馬齒莧抗氧化澄清飲料的配方，得到相對最佳的配方：馬齒莧酶解液的體積分數(shù)45.2%、甜菊糖苷的質(zhì)量濃度0.23 g/L、檸檬酸的質(zhì)量濃度0.06 g/L。按此配方配制的馬齒莧抗氧化澄清飲料中，多糖的質(zhì)量濃度為 2.40 mg/L，黃酮的質(zhì)量濃度為3.86 mg/L，飲料呈現(xiàn)酒紅色、澄清透明、酸甜適宜，具有良好的抗氧化功能。

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Optimization of Preparation Technology for Antioxidant Clarified Beverage withLby Box-Behnken

CHEN Ling1, LUO Lu-jia1, YU Lei2

(1. School of Modern Agricultural，Jiaxing Vocational and Technical College, Zhejiang Jiaxing 314036, China; 2. Zhejiang Dexin Beverage Co., Ltd., Zhejiang Jiaxing 314000, China)

The paper aims to compare the activity dry and freshL. and their DPPH scavenging rates, and select enzymatic hydrolysate ofL. with high antioxidant activity as functional raw material to optimize the formulation of antioxidant beverage ofL.. Taking enzymatic hydrolysate ofL., stevioside and citric acid as independent variables and sensory score of beverages as response value, Box-Behnken response surface methodology are used to optimize the processing technology of antioxidant clarified beverage ofL. The content of polysaccharide and flavone in the enzymatic hydrolysate of freshLis higher than that of dryL, and the clearance rate of DPPH is also higher than that of dryL.. Under the conditions of 45.2% of enzymatic hydrolysis liquid, 0.23 g/L of stevioside and 0.06 g/L of citric acid, the theoretical sensory score ofL. beverage is 33.2 points, and the actual score is 33.3 points. Its antioxidant capacity is good (the DPPH clearance rate is 34.6% when the beverage dosage is 0.60 mL). The predicted value of the regression model is close to the measured value, and the optimization of the processing technology ofL. antioxidant beverage by response surface method is reasonable and feasible. The prepared antioxidant beverage ofLis wine red, clear and transparent, and suitable for sweet and sour.

Box-Behnken design;L.; clarified beverage; antioxidant

TS275.4

A

1001-3563(2022)11-0147-07

10.19554/j.cnki.1001-3563.2022.11.019

2021–10–28

浙江省嘉興市科技局項目（2018AY11013）

陳凌（1962—），女，嘉興職業(yè)技術學院教授，主要研究方向為植物源食品抗氧化劑。

責任編輯：彭颋