接種高溫嗜熱菌劑加快牛糞秸稈堆肥發(fā)酵進程

李再興，馬 駿，武肖莎，黃亞麗，秦 學，滕志楠，趙 凱，張 凡

（1 河北科技大學環(huán)境科學與工程學院，河北石家莊 050018；2 河北省污染防治生物技術實驗室，河北石家莊 050018；3 河北昊源環(huán)境工程有限公司，河北石家莊 050011；4 河北省農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心，河北石家莊 050049）

目前我國每年畜禽糞污總產(chǎn)生量已達到38億t，其中80%以上來源于規(guī)?；B(yǎng)殖場[1]。由于規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場與種植業(yè)在距離和養(yǎng)分供需上都存在脫節(jié)，造成畜禽糞污資源化利用效率低。高溫堆肥技術以穩(wěn)定化、腐殖化和無害化為目標，是實現(xiàn)畜禽糞便資源化利用重要的手段之一[2-3]。然而，這一技術的高溫堆肥工藝(50℃～60℃)存在木質(zhì)纖維素降解難、發(fā)酵周期長、氮素損失大、堆肥腐熟度低、無害化不徹底等問題，這不僅降低堆肥產(chǎn)品的價值，還會滋生惡臭與滲濾液污染[4]。此外，傳統(tǒng)的高溫堆肥技術也已不能滿足日益增長的畜禽糞污處理的需求以及堆肥產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)的要求，因此，亟需突破傳統(tǒng)高溫堆肥的技術壁壘。

超高溫堆肥即在傳統(tǒng)的好氧堆肥的基礎上，在不依賴外源加熱情況下，通過接種含有極端嗜熱微生物的微生物菌劑，使堆體的溫度迅速達到80℃以上并持續(xù)5～7天的好氧發(fā)酵過程[5-6]。提高堆肥溫度可有效降低木質(zhì)纖維素類難降解有機物的結晶度，促進有機質(zhì)降解，從而加速堆肥腐殖化進程，縮短發(fā)酵周期[7-8]。研究表明，大部分難降解木質(zhì)纖維素類物質(zhì)是在堆肥高溫期由嗜熱細菌和真菌降解的。因此，接種專用于超高溫堆肥的微生物菌劑是實現(xiàn)畜禽糞便超高溫堆肥的重要手段之一。同時，較高的溫度并且維持時間長，有利于殺死大部分致病菌、病毒，增強抗生素及抗性基因的去除，使得堆肥無害化程度更徹底[9]。劉曉明等[10]指出在污泥超高溫堆肥過程中，水溶性有機物(DOM)的芳香化和腐殖化程度逐漸增強。廖漢鵬等[11]在污泥堆肥發(fā)酵中接種了極端嗜熱微生物菌劑，使得污泥自發(fā)熱，堆體溫度上升至80℃以上，將堆肥周期縮短至20天左右。崔鵬等[12]研究表明，超高溫堆肥技術顯著提高微生物能量代謝、碳水化合物代謝等產(chǎn)熱相關代謝通路豐度，增加有氧呼吸鏈相關功能基因豐度，在氧化亞氮減排、氮素保留、抗性基因去除等方面具有顯著優(yōu)勢。Yu等[13]研究表明，相比于傳統(tǒng)的高溫堆肥，超高溫堆肥可降解類蛋白質(zhì)，同時增加腐殖質(zhì)的生成，腐殖化更加迅速。

超高溫堆肥技術的實現(xiàn)需要高溫嗜熱菌劑的支持?；诖?，本研究擬在堆肥中接種由本課題組研發(fā)的高溫嗜熱菌劑，通過監(jiān)測堆肥的溫度、含水率、pH、電導率(EC)值、種子發(fā)芽率指數(shù)(GI)、木質(zhì)纖維素降解、細菌豐度等參數(shù)，探究該菌劑在牛糞＋玉米秸稈堆肥發(fā)酵中的效果，以期為促進畜禽糞便快速腐熟，提升堆肥產(chǎn)品質(zhì)量提供理論與實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的牛糞取自河北省石家莊市元氏康順奶牛養(yǎng)殖場的新鮮糞便，玉米秸稈取自當?shù)剞r(nóng)戶，粉碎為≤5 cm小段。牛糞和玉米秸稈的理化性質(zhì)見表1。本試驗所用的GLL菌劑由本課題組所篩選的在高溫下可以正常生長并分泌纖維素酶的嗜熱菌種進行組配，包括普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)G1、地尿素芽孢桿菌(Ureibacillus terrenus) L2、嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrificans) L8，其中菌株G1∶L2∶L8混合比例為1∶4∶3。GLL菌劑的有效活菌數(shù)為 3×108CFU/mL，符合 GB20287—2006[14]的規(guī)定。市售菌劑A為河南省態(tài)沐生物科技有限公司生產(chǎn)的有機肥發(fā)酵劑，主要菌種包括酵母菌、芽孢桿菌等；市售菌劑B為山東貝佳生物科技有限公司生產(chǎn)的有機肥發(fā)酵菌劑，主要菌種包括芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、木霉菌、固氮菌、乳酸菌等。

表1 堆肥原料理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of raw materials for composting

堆肥試驗裝置為具有保溫層的70 L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐底部連接氣體流量計的曝氣裝置，發(fā)酵罐的上、中、下層分別設有溫度探頭，連接自動記錄儀對溫度進行實時監(jiān)控。

1.2 試驗設計

堆肥試驗設4個處理，不加菌劑對照(CK)、添加GLL菌劑(GLL)、添加市售菌劑A (A)、添加市售菌劑B (B)，所有處理堆肥原料配比均為30 kg牛糞+8 kg玉米秸稈，除CK外，其他3個處理的菌劑添加量均為3‰。堆肥發(fā)酵過程中，控制曝氣速度為7 L/min，發(fā)酵周期為30天。分別在堆肥第0、3、7、12、16、23、30天取樣，樣品共分為3份：一份烘干、粉碎及過篩后，測定堆肥樣品的木質(zhì)纖維素含量；一份鮮樣4℃冷藏保存，制取堆肥水浸提液，測定含水率、pH、EC值和種子發(fā)芽率指數(shù)(GI)等；一份鮮樣-80℃冷凍保存，用于測定細菌的群落結構。

1.3 檢測項目及方法

堆肥發(fā)酵期間的溫度由自動記錄儀實時監(jiān)測。含水率采用105℃烘干法測定。pH和電導率(EC)以肥水質(zhì)量比1∶5浸提，pH采用酸度計測定，EC值采用電導率測定儀進行測定。種子發(fā)芽率指數(shù)(GI)參考文獻[15]的方法測定并計算，GI=(堆肥處理種子發(fā)芽率×種子根長)/(蒸餾水處理的種子發(fā)芽率×種子根長)×100%。纖維素、半纖維素、中性洗滌纖維(NDF)以及木質(zhì)素的含量采用ANKOM 2000i全自動纖維測定儀進行測定。細菌豐度由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測定。堆肥產(chǎn)物有機質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)、總養(yǎng)分、水分、酸堿度、GI值以及機械雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)的測定方法參照NY/T 525—2021[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017、IBM SPSS Statistics 26和Origin2018 64bit等軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理分析。

2 結果與分析

2.1 溫度

堆肥溫度的高低顯著影響著發(fā)酵過程中有機質(zhì)的分解和微生物群落的演替，也是檢驗添加GLL菌劑是否能夠?qū)崿F(xiàn)超高溫堆肥以及快速殺死堆肥中有害微生物的重要指標[17]。由堆肥發(fā)酵過程溫度的變化(圖1)可知，CK、A、B處理在堆肥第3天進入高溫期(56.3℃、59.2℃、57.6℃)，CK、A、B處理的高溫階段分別持續(xù)了10、11、13天，各處理高溫的平均溫度和持續(xù)時間均符合畜禽糞便無害化的要求[18]。相較CK處理，A和B處理在發(fā)酵過程中的溫度上升更迅速，高溫期也更長，但是兩者均未實現(xiàn)超高溫堆肥。這是由于市售菌劑的微生物多為中高溫菌株，當溫度過高時，菌株的活性便急劇下降，導致堆體溫度維持原狀甚至下降。相反，GLL處理在堆肥第2天內(nèi)迅速升溫至85.8℃，標志著堆體進入超高溫階段(≥80℃)[5-6]，超高溫期持續(xù)了5天，高溫期又持續(xù)到第18天。研究發(fā)現(xiàn)，堆肥積溫提高可縮短發(fā)酵周期[19-20]，由于GLL處理的堆體溫度高，有機質(zhì)降解反應更為劇烈，有利于縮短堆體的發(fā)酵周期，加快有機質(zhì)降解。

圖1 接種不同菌劑堆肥過程中的溫度變化Fig. 1 Temperature changes during composting as affected by agent inoculation

2.2 含水率

堆肥過程中物料的含水率控制在50%～70%更有利于微生物的活動[21]。由圖2可知，堆肥發(fā)酵期間，CK、A、B、GLL處理的堆體最初含水率分別為65.3%、66.3%、66.0%、66.7%，隨著堆肥時間的延長呈下降趨勢。在堆肥第16天，GLL處理的堆體含水率為44.3%，而CK、A、B處理的堆體含水率分別為50.2%、48.7%、47.3%。GLL處理的堆體含水率下降速率明顯高于CK、A、B處理，因為GLL處理的堆體溫度明顯高于其他處理，更有利于水分的蒸發(fā)。堆肥結束時，CK、A、B處理的含水率分別為45.4%、43.8%、44.6%，A、B處理的堆肥含水率與CK沒有顯著差異，而GLL處理的含水率為34.3%，顯著低于CK和A、B處理，表明接種GLL高溫嗜熱菌劑實現(xiàn)的超高溫堆肥也促進了堆肥含水率的下降。

圖2 接種不同菌劑堆肥過程中含水率變化Fig. 2 Changes in moisture content during composting as affected by agent inoculation

2.3 pH和EC值

堆肥pH影響著堆肥微生物的代謝活動，也影響著堆肥過程氨的揮發(fā)[22]。從圖3中可以看出，CK、A、B和GLL處理的pH在整體上呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，這是由于隨著堆肥的進行，堆肥原料中的蛋白質(zhì)發(fā)生脫氨基作用，氨氣的釋放會提高pH[23]。在堆肥發(fā)酵過程中，不同處理的pH差異不明顯，說明添加外源菌劑不會影響堆肥的pH。Cui等[24]研究發(fā)現(xiàn)超高溫反而有助于氮素的保留。堆肥末期，各處理的pH趨于穩(wěn)定，CK、A、B、GLL處理的pH均在8.0～9.0。

圖3 接種不同菌劑堆肥過程中pH和EC值變化Fig. 3 Changes in pH and EC value during composting as affected by agent inoculation

堆肥EC值反映著堆肥產(chǎn)物的植物安全性。EC值的變化與有機質(zhì)的礦化和腐殖化過程相關。4個處理的EC值均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，CK、A處理EC峰值出現(xiàn)在堆肥第16天，B、GLL處理出現(xiàn)在堆肥第7天。堆肥結束后，CK、A、B、GLL處理的EC值分別為2.13、1.99、2.03、1.95 μS/cm，菌劑的添加導致堆肥EC值下降。

2.4 種子發(fā)芽率指數(shù)(GI值)

種子發(fā)芽率指數(shù)(GI值)是評價堆肥腐熟度和表征安全性的一個主要生物指標，一般堆肥的GI值必需超過80%[25-26]。由堆肥過程中的GI值的變化(圖4)，可知，CK、A、B、GLL處理的GI值均隨發(fā)酵時間呈現(xiàn)上升趨勢，其中GLL處理GI值的上升最為迅速，在堆肥的第16天，GI值已經(jīng)達到80%以上，而CK、A、B處理分別需要30、23、23天才能達到80%以上。因此，接種GLL菌劑可以加快堆肥的腐殖化進程，有效縮短發(fā)酵周期7～14天。

圖4 接種不同菌劑堆肥過程中GI變化Fig. 4 Changes in GI during composting as affected by agent inoculation

2.5 木質(zhì)纖維素的變化

木質(zhì)纖維素的降解體現(xiàn)了堆肥的穩(wěn)定化和腐殖化進程。木質(zhì)纖維素包括半纖維素、纖維素、木質(zhì)素等。圖5顯示，在堆肥發(fā)酵過程中，各處理的牛糞+秸稈混合物料的木質(zhì)纖維素含量均逐漸降低，降解率逐漸增加。纖維素、木質(zhì)素的降解主要發(fā)生在堆肥高溫期。在堆肥發(fā)酵第7、30天時，A、B、GLL處理的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解率較CK處理顯著增加，尤其是GLL處理的木質(zhì)纖維素降解更為顯著，這說明提高堆肥溫度有助于纖維素類和木質(zhì)素的降解。牛明杰等[27]研究發(fā)現(xiàn)，半纖維素的主要降解階段為堆肥穩(wěn)定期，堆肥結束時降低了38.8%，纖維素和木質(zhì)素僅在堆肥高溫期有少量降解，分別降解了11.7%和18.5%。吳耀領等[28]從丟棄酒糟中篩選到3株纖維素降解菌MM2、MM6和MX8，并按照1∶1∶1復配復合菌劑，研究發(fā)現(xiàn)3種不同復合菌劑接種量(0.6%、0.8%、1.0%)酒糟中的纖維素分別降解了28.6%、34.8%和37.0%，對照組纖維素僅降解了18.0%，接種復合菌劑明顯促進酒糟堆肥腐熟和縮短堆肥周期。堆肥發(fā)酵后，GLL處理堆肥后的木質(zhì)纖維素含量比堆肥初始值下降了70.7%，下降幅度明顯高于CK、A、B處理，半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量在堆肥后分別下降81.6%、65.2%和53.7%。高華等[29]研究發(fā)現(xiàn)加入微生物菌劑可明顯提高堆肥過程脫氫酶的活性，有利于纖維素等有機質(zhì)的氧化降解。因此，在堆肥中添加嗜熱GLL菌劑可能通過提高脫氫酶的活性，從而提高了木質(zhì)纖維素的降解效率。

圖5 接種不同菌劑堆肥過程中木質(zhì)纖維素的變化Fig. 5 Changes in lignocellulose during composting as affected by agent inoculation

2.6 細菌豐度

為探究在超高溫堆肥過程中細菌群落的變化，對GLL處理堆肥前7天的細菌群落在門水平上相對豐度的變化進行分析。從圖6可以看出，超高溫堆肥過程中，在堆肥第0、3、7天的細菌群落之間有著巨大的差異。堆肥第0天，細菌群落主要有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)以及擬桿菌門(Bacteroidetes)，其中，變形菌門和厚壁菌門是主要的菌門，共占細菌總序列的68.4%。隨著堆肥進入高溫及超高溫期，變形菌門、擬桿菌門占總序列的比例分別減少到8.5%、14.4%，厚壁菌門占總序列的比例逐漸增加到46.6%。厚壁菌門和放線菌門是降解木質(zhì)纖維素的主要細菌菌群[30-31]。接種GLL處理的堆體在發(fā)酵的第2天溫度就升至85.8℃，且持續(xù)5天，堆肥第3～7天厚壁菌門相對豐度的增加說明其可耐受超高溫，高溫期纖維素的降解主要是由厚壁菌門完成的，同時釋放熱量將堆體推向更高的溫度，提高堆肥產(chǎn)物的質(zhì)量。李瑋琳等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在堆肥早期和中期(0～10天)，添加菌劑可提高堆肥中的厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度，從而提高木質(zhì)纖維素等難降解有機質(zhì)的降解。李昌寧等[19]研究表明，在堆肥的高溫期，未接種菌劑的傳統(tǒng)高溫堆肥中厚壁菌門的相對豐度僅為17.4%，遠小于本研究接種GLL菌劑的堆肥處理在高溫期厚壁菌門的相對豐度(46.6%)。因此，在堆肥過程中接種GLL菌劑可能通過提高堆肥發(fā)酵過程中厚壁菌門等優(yōu)勢細菌群落的豐度，促進堆體升溫并延長高溫時期，進而有效提高木質(zhì)纖維素的降解能力，縮短堆肥的腐熟周期。

圖6 接種GLL菌劑不同時間堆肥中門水平細菌的相對豐度Fig. 6 The relative abundance of bacteria at phylum in different time of composting with GLL inoculation

2.7 堆肥產(chǎn)品質(zhì)量檢測

參照NY/T 525—2021[16]農(nóng)業(yè)標準中對有機肥料的要求，檢測了接種GLL菌劑超高溫堆肥發(fā)酵后堆肥產(chǎn)物的有機質(zhì)、總養(yǎng)分、水分和機械雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)及酸堿度、GI值(表2)。超高溫堆肥后，堆肥產(chǎn)物的有機質(zhì)、總養(yǎng)分和機械雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)、酸堿度、GI值均滿足NY/T 525—2021[16]的要求，含水率略高于該標準的要求。因此，超高溫堆肥對畜禽廢棄物的無害化效果良好，基本滿足了NY/T 525—2021[16]中的要求。

表2 接種GLL堆肥產(chǎn)物檢測結果Table 2 Testing results of compost products inoculated with GLL

3 結論

接種GLL菌劑處理可在堆肥第2天達到超高溫(85.8℃)，而其他菌劑只能達到高溫，較傳統(tǒng)堆肥該階段較高的高溫嗜熱菌厚壁菌門(46.6%)的相對豐度十分有利于堆肥材料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分解，促進了水分的蒸發(fā)以及有害微生物的消除，因而，其GI值在堆肥的第16天就超過80%，在堆肥30天產(chǎn)品質(zhì)量達到堆肥產(chǎn)物質(zhì)量標準NY/T 525—2021的要求，較傳統(tǒng)堆肥和接種普通菌劑大大縮短了堆肥周期，提高堆肥發(fā)酵效率。