柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究※

閻思寧 李奇洪 盧朝睿 郭峻峰 李紫鈺 趙澤瑋 王佳藝 王寶家

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)2018級(jí)本科生，四川 成都 610036；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)2019級(jí)本科生，四川 成都 610036；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院溫病教研室，四川 成都 610036)

肝纖維化是指由多種致病因素所致肝細(xì)胞外纖維組織異常增生的病理變化過程，在國(guó)際疾病分類(ICD-10)中亦可作為一種病名(K74.001)[1]。肝纖維化是慢性肝病的重要結(jié)局，持續(xù)發(fā)展又可導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭，甚至發(fā)展為肝細(xì)胞癌[2]。慢性肝病是影響人們健康的主要疾病之一，全世界每年約有200萬(wàn)人死于肝病，占全球死亡人數(shù)的3.5%，其中約100萬(wàn)人死于肝硬化并發(fā)癥，約100萬(wàn)人死于病毒性肝炎和肝細(xì)胞癌[3-4]。因此，阻止肝纖維化的發(fā)展或逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程是防治慢性肝病進(jìn)一步發(fā)展、降低病死率的關(guān)鍵[5-6]。根據(jù)肝纖維化患者的臨床癥狀表現(xiàn)，可以將其歸屬于中醫(yī)學(xué)黃疸、脅痛、鼓脹、肝積等肝系疾病范疇?，F(xiàn)代研究表明，四逆散[7-8]、小柴胡湯[9-11]、小柴胡湯合當(dāng)歸芍藥散[12]、血府逐瘀湯[13]、柴胡疏肝散[14]等經(jīng)方在治療肝纖維化方面效果顯著。我們通過綜合分析上述方劑，發(fā)現(xiàn)柴胡和白芍都是方中的重要藥物，也是治療肝系疾病的常用配伍藥對(duì)[15-16]。柴胡味辛、苦，性微寒，入肝、膽、肺經(jīng)，能引藥入肝，主疏肝，是重要的引經(jīng)藥，常用于和解表里，升舉陽(yáng)氣，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰其“主心腹腸胃中結(jié)氣”。白芍味苦、酸，性微寒，入肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血柔肝、調(diào)經(jīng)止痛的功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰其能“除血痹，破堅(jiān)積，治寒熱疝瘕”。柴胡和白芍兩者合用，可疏肝柔肝，升陽(yáng)益木，既可以消散長(zhǎng)期滯留于肝的癥瘕，又能滋養(yǎng)正邪抗?fàn)幩牡母窝，F(xiàn)代多項(xiàng)研究表明柴胡、白芍配伍具有解毒、抗炎、保肝等藥理作用，且療效甚佳[17-18]。目前，柴胡和白芍治療肝纖維化的藥理研究多側(cè)重于單藥及復(fù)方，其研究結(jié)果較局限或?qū)挿海形窗l(fā)現(xiàn)能揭示柴胡與白芍配伍治療肝纖維化作用機(jī)制的研究成果。因此，我們擬通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，獲取柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化的主要活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，分析其治療肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 研究方法

1.1 柴胡-白芍藥對(duì)活性成分篩選與作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，分別以“柴胡”和“白芍”為關(guān)鍵詞檢索柴胡和白芍中的化學(xué)成分。參考藥物動(dòng)力學(xué)原理，以口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，預(yù)測(cè)柴胡和白芍的活性成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的活性成分，獲得其相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)對(duì)靶點(diǎn)的基因名稱進(jìn)行校正。

1.2 肝纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 以“l(fā)iver fibrosis”為檢索詞，分別在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)中進(jìn)行檢索，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)取并集，剔除重復(fù)值后保留唯一值，獲得肝纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。將柴胡-白芍藥對(duì)以及肝纖維化的靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venn Diagram平臺(tái)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)，相互映射后得到藥對(duì)與疾病的交集靶點(diǎn)，即柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 “藥對(duì)-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-肝纖維化”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在Excel軟件中通過VLOOKUP函數(shù)將關(guān)鍵靶點(diǎn)與藥對(duì)活性成分進(jìn)行精確匹配，制作Network和Type文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建“藥對(duì)-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-肝纖維化”網(wǎng)絡(luò)圖。在“Tools”中選擇“Network Analyzer”進(jìn)行拓?fù)浞治觯玫礁鱾€(gè)靶點(diǎn)的Degree值，即每個(gè)節(jié)點(diǎn)的連線數(shù)目。篩選出Degree值排名前3的活性成分作為關(guān)鍵成分，節(jié)點(diǎn)大小依據(jù)Degree值設(shè)置，Degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大。

1.4 “藥對(duì)-肝纖維化”關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建 將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi/input.pl)進(jìn)行PPI構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，可信度設(shè)置為>0.9，獲得PPI的tsv文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI可視化網(wǎng)絡(luò)。用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯玫礁鱾€(gè)靶點(diǎn)的Degree值，節(jié)點(diǎn)大小和顏色依據(jù)Degree值設(shè)置，同時(shí)篩選出Degree值排名前15的靶點(diǎn)，作為核心靶點(diǎn)[19]。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因本體(GO)富集分析與京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析 借助Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)進(jìn)行GO富集分析與KEGG富集分析。將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，“Analysis as species”選擇“H.sapiens”，提交數(shù)據(jù)后在“Enrichment”選項(xiàng)卡中依次選擇GO生物過程(biological processes,BP)、分子功能(molecular functions,MF)、細(xì)胞組成(cellular components,CC)及KEGG通路(KEGG Pathway)進(jìn)行富集分析，篩選得到同時(shí)滿足至少含有3個(gè)靶點(diǎn)、P≤0.01、富集程度≥0.15條件的數(shù)據(jù)，并將得到的數(shù)據(jù)處理后導(dǎo)入微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/login)繪制氣泡圖。

1.6 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接 選取“藥對(duì)-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-肝纖維化”網(wǎng)絡(luò)中得到的3個(gè)關(guān)鍵活性成分，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下載獲得其SDF結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Chem3D 18.0軟件進(jìn)行優(yōu)化；在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前5的核心靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)編號(hào)，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/50)中下載其受體結(jié)構(gòu)，并將其導(dǎo)入PyMOL軟件，除去這些目標(biāo)蛋白質(zhì)的水分子和非活性配體，最后將其導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6軟件添加極性氫和電荷，并構(gòu)建活性口袋，這些活性口袋被保存為PDBQT格式文件備用。通過調(diào)整靶蛋白X—Y—Z坐標(biāo)和網(wǎng)格大小，優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)的位置進(jìn)行分子對(duì)接。運(yùn)行AutoDock Vina軟件將處理過的活性化合物對(duì)接到目標(biāo)蛋白質(zhì)10次，每次對(duì)接的最低結(jié)合能作為最終結(jié)果。最后應(yīng)用PyMOL軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化處理，對(duì)接復(fù)合物。

2 結(jié)果

2.1 柴胡-白芍藥對(duì)活性成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 檢索到滿足條件的活性成分共計(jì)29個(gè)，其中柴胡16個(gè)，白芍12個(gè)，兩者共有成分1個(gè)。將29個(gè)活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)并去重后，得到靶點(diǎn)187個(gè)，其中有9個(gè)活性成分無(wú)法匹配到靶點(diǎn)，因此該187個(gè)靶點(diǎn)來自柴胡和白芍中的20個(gè)活性成分，其中柴胡12個(gè)，白芍7個(gè)，兩者共有成分1個(gè)。

2.2 肝纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 從OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中得到152個(gè)靶點(diǎn)，從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得7777個(gè)靶點(diǎn)，取3次中位數(shù)篩選得到973個(gè)靶點(diǎn)，取兩者的并集得到肝纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)1081個(gè)。將柴胡-白芍藥對(duì)的187個(gè)靶點(diǎn)及肝纖維化疾病相關(guān)1081個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venn Diagram平臺(tái)進(jìn)行映射取交集，得到柴胡-白芍藥對(duì)與肝纖維化疾病相交的靶點(diǎn)共92個(gè)，即柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)，韋恩圖見圖1。

圖1 柴胡-白芍藥對(duì)靶點(diǎn)與肝纖維化靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.2 “藥對(duì)-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-肝纖維化”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在Excel軟件中匹配柴胡-白芍藥對(duì)20個(gè)活性成分和肝纖維化92個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)后發(fā)現(xiàn)，有1個(gè)柴胡活性成分和2個(gè)白芍活性成分無(wú)法匹配到疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，故最終篩選出柴胡-白芍藥對(duì)的活性成分共17個(gè)，見表1。將制作的Network和Type文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件后，繪制“藥對(duì)-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-肝纖維化”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖 2。由圖2可知，網(wǎng)絡(luò)共有112個(gè)節(jié)點(diǎn)和273條邊，正方形藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表藥對(duì)，圓形節(jié)點(diǎn)代表活性成分(其中粉色節(jié)點(diǎn)為柴胡活性成分，紫色節(jié)點(diǎn)為白芍活性成分，綠色節(jié)點(diǎn)為兩者共有活性成分)，菱形紅色節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶點(diǎn)，三角形橙黃色節(jié)點(diǎn)代表肝纖維化，“CH”節(jié)點(diǎn)代表柴胡，“BS”節(jié)點(diǎn)代表白芍，其余CH&BS、CH1～CH11及BS1～BS5所代表的成分見表1。篩選得到Degree值排名前3的核心成分依次為柴胡的槲皮素(quercetin)(Degree值83)、柴胡和白芍共有的山奈酚(kaempferol)(Degree值31)、白芍的β-谷甾醇(β-sitosterol)(Degree值11)，推測(cè)這3種活性成分是柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化的主要活性成分。

表1 柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化的活性成分信息

圖2 藥對(duì)-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-肝纖維化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3 藥對(duì)-肝纖維化關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI構(gòu)建 將從String平臺(tái)獲得的tsv格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2后，繪制藥對(duì)-肝纖維化關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI圖，包含92個(gè)節(jié)點(diǎn)和1766條邊，節(jié)點(diǎn)平均Degree值為38.4，無(wú)孤立的節(jié)點(diǎn)，見圖3。靶點(diǎn)Degree值越大，則在圖中的節(jié)點(diǎn)越大，顏色越接近網(wǎng)絡(luò)中心的白細(xì)胞介素6(IL-6)節(jié)點(diǎn)。篩選出Degree值排名前15的關(guān)鍵靶點(diǎn)共18個(gè)，其中有4個(gè)靶點(diǎn)Degree值排名并列第15，推測(cè)這18個(gè)靶點(diǎn)為柴胡、白芍治療肝纖維化的核心靶點(diǎn)，依次為IL-6(Degree值77)、腫瘤壞死因子(TNF)(Degree值77)、蛋白激酶B1(Akt1)(Degree值76)、TP53(Degree值73)、IL-1β(Degree值73)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)(Degree值71)、基質(zhì)金屬蛋酶9(MMP-9)(Degree值68)、Jun(Degree值67)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)(Degree值65)、CXC趨化因子配體8(CXCL8)(Degree值65)、胱天蛋白酶3(CASP3)(Degree值65)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)(Degree值64)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARG)(Degree值63)、缺氧誘導(dǎo)因子1A(HIF1A)(Degree值62)、MYC(Degree值61)、雌激素受體基因1(ESR1)(Degree值61)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)(Degree值61)、趨化因子2(CCL2)(Degree值61)。

圖3 柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI圖

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析與KEGG富集分析 分析92個(gè)靶點(diǎn)得到的GO富集條目5625條，其中BP共4765條，MF共528條，CC共332條。分別以P≤0.01為條件篩選排名前10的富集條目導(dǎo)入微生信平臺(tái)，繪制GO氣泡圖(見圖4)，其中BP主要涉及脂多糖反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、無(wú)機(jī)物反應(yīng)(response to inorganic substance)、損傷反應(yīng)(response to wounding)、凋亡信號(hào)通路(apoptotic signaling pathway)、細(xì)胞移動(dòng)正調(diào)控(positive regulation of cell migration)等過程；MF主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(protein domain specific binding)等；CC主要涉及囊腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)等。KEGG富集分析顯示靶點(diǎn)所在通路共有414條，以P≤0.01為閾值取排名前10的富集條目，繪制氣泡圖(見圖4)其結(jié)果涉及癌癥通路(pathways in cancer)、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型病毒性肝炎(Hepatitis B)、IL-17 信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、丙型病毒性肝炎(Hepatitis C)等通路。

BP

2.5 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果 最終選取了槲皮素、山奈酚及β-谷甾醇這3種關(guān)鍵活性成分與TNF、IL-6、Akt1、TP53、IL-1β這5個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在配體結(jié)合受體環(huán)節(jié)，結(jié)合能越弱，構(gòu)象穩(wěn)定性則越強(qiáng)。一般認(rèn)為，結(jié)合能<-4.25 kcal/mol的配體和受體有一定的結(jié)合活性，<-5.0 kcal/mol則說明結(jié)合活性較好，<-7.0 kcal/mol則說明結(jié)合活性強(qiáng)烈[20-21]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，上述3種活性成分分別與5個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接的結(jié)合能均<-4.25 kcal/mol，均有一定的結(jié)合活性，其中“槲皮素與IL-6、Akt1、TP53”“山奈酚與TNF、IL-6、Akt1、IL-1β”及“β-谷甾醇與IL-6、Akt1、TP53”的結(jié)合能<-5.0 kcal/mol，表明這些關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)之間可以形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。見表2。

表2 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

通過上述研究我們發(fā)現(xiàn)，柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化的3種主要活性成分為槲皮素、山奈酚及β-谷甾醇。槲皮素是一種黃酮類多酚化合物，通常以槲皮素糖苷的形式存在于天然植物中，具有抗纖維化、抗炎癥、抗腫瘤、抗病毒等作用，亦可用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[22]。細(xì)胞損傷會(huì)促進(jìn)炎癥因子的分泌，是肝纖維化發(fā)病的最初因素，而槲皮素可以保護(hù)急性肝細(xì)胞損傷，從而阻止肝臟進(jìn)一步纖維化[23]。有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素還可以通過調(diào)控肝纖維化過程中起主導(dǎo)作用的肝星狀細(xì)胞，抑制膠原蛋白的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[24]，抑制膠原聚集，降低膠原總量來抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化[25-26]。槲皮素的抗炎作用可以通過負(fù)調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)，從而抑制脂多糖誘導(dǎo)膜表面的黏附分子及IL-1、IL-6、IL-10等炎癥因子表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[27]。還有研究報(bào)道顯示，槲皮素抗腫瘤的作用不局限于直接抑制腫瘤發(fā)展，還可以通過增強(qiáng)其他合用藥物的療效來間接增強(qiáng)抗腫瘤療效，抑制癌前病變[28]。山奈酚亦是一種黃酮類多酚化合物，大量存在于水果、蔬菜及中藥材中，具有抗炎、抗氧化、抗癌、保護(hù)損傷組織等作用，是重要的膳食抗炎劑[29]。山奈酚的抗炎和抗腫瘤作用顯著，能明顯抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，被用于治療骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、呼吸窘迫綜合征等多種急慢性炎癥疾病，以及肝細(xì)胞癌、食管癌、乳腺癌等多種癌癥[30]。有研究表明，山奈酚可以通過調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白、丁酸受體及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來減輕肝損傷[31]，并通過抑制膠原的合成和肝星狀細(xì)胞的活化，激活活化素受體樣激酶5來顯著改善肝纖維化的形成[32]。β-谷甾醇屬于植物甾醇類成分，在植物油中含量較高，具有抗炎、抗氧化、降低膽固醇、免疫調(diào)節(jié)等作用[33]。實(shí)驗(yàn)研究顯示，β-谷甾醇具有強(qiáng)大的抗炎活性，其效果類似于腹腔注射氫化可的松和羥基保泰松[34]。有研究表明，β-谷甾醇可以通過抑制一氧化氮(NO)合成和IL-6活性，減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的分泌來實(shí)現(xiàn)抗炎作用[35]。β-谷甾醇還可以通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途徑下調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)慢性酒精性肝損傷的保護(hù)[36]。

自然界植物中大部分的槲皮素和山奈酚是依附于糖基存在的，糖的種類和附著物影響其OB，從而影響其生物活性[37]，且槲皮素水溶性差，穩(wěn)定性低[38]。近年來有一些增加槲皮素溶解度的相關(guān)研究，致力于增加其可溶性，以提高OB，并取得了一定的研究成果[39]。TCSMP檢索到槲皮素、山奈酚的OB值分別為46.43%和41.88%，處于中等水平。我們認(rèn)為可以進(jìn)一步研究分析柴胡和白芍中糖類化合物種類，從而在臨床上聯(lián)合應(yīng)用糖類化合物，以增加有效成分的OB。此外，在臨床應(yīng)用柴胡類經(jīng)方治療肝纖維化時(shí)，是否應(yīng)靈活加大柴胡和白芍的用量，以提高入血的成分濃度，使其充分發(fā)揮療效，也是有待考究的問題。

根據(jù)PPI圖分析可以發(fā)現(xiàn)，TNF、IL-6、Akt1、TP53、IL-1β等靶點(diǎn)的Degree值較高，是柴胡-白芍藥對(duì)干預(yù)肝纖維化的潛在核心靶點(diǎn)，也是連接其他節(jié)點(diǎn)的核心樞紐。TNF主要來源于巨噬細(xì)胞和免疫細(xì)胞，可以調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫，是免疫系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)成分，亦是慢性炎癥性疾病的有效治療手段，但其在機(jī)體感染或組織損傷時(shí)卻又會(huì)被激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)并維持炎癥發(fā)生[40-41]。此外，TNF既對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，又可作為強(qiáng)大的致炎因子，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[42]。IL-6是人體內(nèi)重要的炎癥因子，可以促進(jìn)肝內(nèi)的炎性反應(yīng)，介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞分化增殖，刺激纖維組織不斷增生，使慢性肝臟炎癥持續(xù)發(fā)展[43]。Akt1則在酒精性肝病病情發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮著核心作用，其中包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)錄，同時(shí)可損害細(xì)胞導(dǎo)致其凋亡，進(jìn)一步導(dǎo)致纖維化的發(fā)生發(fā)展，有研究表明Akt1可能以PI3K依賴的方式被類似的信號(hào)通路激活[44]。TP53是肝細(xì)胞癌重要的啟動(dòng)基因之一，TP53伴乙型肝炎病毒引起的肝硬化被認(rèn)為是第二危險(xiǎn)的基因組合[45]。IL-1β是最早被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子之一，由成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞及癌細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，長(zhǎng)期以來被視為疾病發(fā)展過程中介導(dǎo)炎癥及調(diào)節(jié)生理的重要因子[46]。有研究顯示，抗癌治療能夠促進(jìn)癌細(xì)胞或免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，對(duì)癌癥的發(fā)展具有抑制作用[47]?？偠灾?，本研究顯示強(qiáng)相關(guān)的靶點(diǎn)對(duì)于肝纖維化進(jìn)程具有正向、負(fù)向或雙向調(diào)控作用，有待進(jìn)一步明確其中共同參與調(diào)控的相關(guān)因子和通路，以為肝纖維化的治療明晰方向。

GO富集分析結(jié)果顯示，脂多糖反應(yīng)和無(wú)機(jī)物反應(yīng)是最主要的2個(gè)生物過程，囊腔是柴胡-白芍藥對(duì)發(fā)揮治療作用的主要細(xì)胞組成，分子功能主要涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子受體結(jié)合及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。囊腔是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本組成結(jié)構(gòu)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能可以概括為蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)的合成和輸出，外與細(xì)胞膜相連,內(nèi)與核膜的外膜相通,將細(xì)胞內(nèi)的各種結(jié)構(gòu)有機(jī)地聯(lián)結(jié)成一個(gè)整體，其中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還具有解毒功能，如肝細(xì)胞中的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以清除脂溶性的廢物和代謝產(chǎn)生的多種有害物質(zhì)。故推測(cè)囊腔是柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化在細(xì)胞內(nèi)的主要作用位置。在正常情況下，脂多糖是大多數(shù)革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，亦可由乙醇等物質(zhì)代謝產(chǎn)生[48]。然而脂多糖對(duì)機(jī)體也存在一定的毒害作用，在肝細(xì)胞病理狀態(tài)下，脂多糖會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子釋放及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞更容易受二次損害，導(dǎo)致肝臟損傷和纖維化持續(xù)存在[49]。由此推測(cè)，柴胡-白芍藥對(duì)可能通過調(diào)節(jié)脂多糖代謝來減少機(jī)體不良化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，從而減少肝臟損傷和纖維化。肝纖維化還與肝內(nèi)的無(wú)機(jī)物反應(yīng)密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鹽會(huì)使肝臟發(fā)生氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞角蛋白18(CK18)中Ⅰ型細(xì)胞角蛋白的表達(dá)，從而進(jìn)一步引發(fā)肝纖維化甚至形成腫瘤[50]。故推測(cè)柴胡-白芍藥對(duì)可能通過阻止外來吸收或代謝內(nèi)生的無(wú)機(jī)物累積作用于肝細(xì)胞，從而減輕無(wú)機(jī)物對(duì)肝臟的不良影響。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，富集靶點(diǎn)數(shù)目最多的是癌癥通路，此外還有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等。已有大量研究表明，肝纖維化是一個(gè)非常主要的癌前病變，在Tsuchida T等[51]構(gòu)建的肝病發(fā)展模型中，表觀遺傳學(xué)變化可表現(xiàn)為“脂肪變性→炎癥→纖維化→癌癥”?，F(xiàn)有研究表明，肝臟成纖維細(xì)胞主要來源于肝臟駐留的造血干細(xì)胞、間皮細(xì)胞及活化的門管區(qū)成纖維細(xì)胞[52]。在肝纖維化進(jìn)程中，許多相關(guān)因子對(duì)纖維化影響的研究結(jié)果尚未統(tǒng)一。如有研究結(jié)果顯示，IL-22可抑制肝纖維化，但也有研究認(rèn)為IL-22在乙型肝炎患者和乙型肝炎小鼠模型中具有促炎和促纖維化作用[53]。推測(cè)柴胡-白芍藥對(duì)可能通過平衡調(diào)控其中的一種或多種因子，從而阻止肝纖維化的發(fā)生或進(jìn)展，防止其向肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)變，充分發(fā)揮中醫(yī)藥“未病先防”“既病防變”的治療作用。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路也是肝纖維化的一個(gè)重要通路。研究顯示，黃腐酚可以通過介導(dǎo)NF-E2相關(guān)因子2(NRF2)/RAGE/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路，減輕2型糖尿病誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性和纖維化[54]。這提示柴胡-白芍藥對(duì)可能對(duì)糖尿病并發(fā)的肝纖維化有明顯療效，但現(xiàn)有相關(guān)研究較少。

最后，為驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，本研究選取柴胡-黃芩藥對(duì)中的主要活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇與核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性較高，進(jìn)一步證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法，初步闡述了柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化可能相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)、活性成分、生物學(xué)過程及信號(hào)通路等協(xié)同作用的分子機(jī)制，主要作用靶點(diǎn)集中在囊腔中由脂多糖反應(yīng)終末產(chǎn)物介導(dǎo)的癌癥通路，為今后進(jìn)一步探索柴胡-白芍藥對(duì)治療肝纖維化豐富了理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)關(guān)于柴胡、白芍藥對(duì)治療肝纖維化的藥理實(shí)驗(yàn)研究提供了參考思路。