二神丸對潰瘍性結腸炎大鼠炎性反應及血小板的影響※

韓森福 李 清 劉 姣 張曉艷 李佩娥 楊 洋 于 博 張正威 趙 靜

(1.河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院2017級本科生，河北 石家莊 050017；2.河北中醫(yī)學院中藥藥理教研室，河北 石家莊 050200；3.河北省中醫(yī)院脾胃病三科，河北 石家莊 050011；4.河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院2018級本科生，河北 石家莊 050017；5.河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院中藥與中藥藥理教研室，河北 石家莊 050017)

潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)是一種以反復發(fā)作腹痛、腹瀉、黏液膿血便及潰瘍?yōu)樘攸c的腸道非特異性炎性疾病，其發(fā)病機制尚不十分明確，可進展為結腸癌，對患者的生活質量和生命健康造成嚴重影響[1]。目前，臨床上常將美沙拉秦作為治療UC的一線藥物，但部分患者長期使用美沙拉秦可產生耐藥性，其療效隨時間發(fā)展而逐漸減低，并可出現惡心、嘔吐、腹痛等不良反應[2]。中醫(yī)藥在治療UC方面具有可靠的療效，根據UC的臨床表現將其歸屬于“久痢”“腸澼”“泄瀉”“痢疾”等范疇。二神丸出自宋·許叔微的《普濟本事方》，由補骨脂、肉豆蔻配伍組成，具有溫脾暖胃、補腎固腸之功，是臨床治療久痢、泄瀉的經典古方。有研究報道認為，除腸道的炎性反應外，血小板(PLT)在UC的發(fā)病中也起著重要作用[3]。本研究采用2，4，6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)-乙醇誘導法建立UC大鼠模型，觀察二神丸對UC模型大鼠炎性反應和PLT的影響，探討二神丸治療UC的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠70只，體質量(180±20) g，適應性飼養(yǎng)7 d，室溫(22±2)℃，相對濕度50%～60%，自由攝食、飲水，均購自河北省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK(冀)2018-004。

1.2 實驗藥物 肉豆蔻、補骨脂(國藥河北樂仁堂醫(yī)藥連鎖有限公司)；美沙拉秦緩釋顆粒(上海愛的發(fā)制藥有限公司，國藥準字H20143164，批號190114)。

1.3 實驗主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 TNBS(美國Sigma公司)；一氧化氮(NO)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；P選擇素(P-selectin)酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測試劑盒、白細胞介素1β(IL-1β)ELISA檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒(化學發(fā)光法)(上海森雄科技實業(yè)有限公司)。

1.3.2 主要儀器 SpectraMax190型全自動酶標儀(美國MD公司)；BC-30Vet型全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；REM-710型切片機(日本大和光機工業(yè)株式會社)；AxioVert A1型倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 二神丸藥物配制

1.4.1.1 二神丸給藥劑量的設計 二神丸出自《普濟本事方》，原方由補骨脂(炒，四兩)、肉豆蔻(二兩)組成，其配伍比例為2∶1?！吨腥A人民共和國藥典》中推薦的補骨脂臨床用量為6～10 g，肉豆蔻用量為3～10 g。綜合二者，確定補骨脂人的用量為10 g，肉豆蔻人的用量為5 g，總用量為15 g。再根據人與大鼠間體表面積折算的等效劑量比值表計算，設定大鼠等效劑量1.575 g/kg為低劑量給藥，其4倍劑量為高劑量給藥。

1.4.1.2 二神丸水煎液的制備 按照傳統中藥的煎煮方法，補骨脂168 g，肉豆蔻84 g，加入8倍量(1000 mL)純凈水中混合浸泡30 min后煎煮，煮沸后保持水沸狀態(tài)1 h，過濾，將濾液倒入燒杯中備用，往濾渣中再加6倍量(750 mL)純凈水，煎煮方法同上，將2次所得濾液合并，將濾液繼續(xù)煎煮，濃縮至所需濃度(0.63 g生藥/mL)，冷卻，冷藏保存。

1.4.2 美沙拉秦緩釋顆?；鞈乙旱闹苽?取適量美沙拉秦緩釋顆粒，用研缽碾碎，將研磨好的藥物粉末與羧甲基纖維素鈉(CMC-NA)溶液按1∶10比例混合，攪拌配制成質量濃度為0.05 g/mL的美沙拉秦緩釋顆?；鞈乙?，冷藏保存。

1.4.3 分組、造模 隨機取10只大鼠作為正常對照組，其余60大鼠均采用TNBS法建立UC模型[4]。所有大鼠禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛(4.0 mL/kg)腹腔注射麻醉，造模組將5%TNBS和75%乙醇(1∶1,V/V)混合液(100 mg/kg)用石蠟油潤滑直徑0.4 mm的膠管一次性注入大鼠直腸7～8 cm深的腸腔內，正常對照組給予等容積0.9%氯化鈉注射液灌注，并將大鼠倒置5 min，使藥液充分滲入腸腔。然后將大鼠放平，使其自然蘇醒，給予正常飲食。隨機處死2只造模大鼠，解剖結腸組織，肉眼可見潰瘍面，周圍黏膜充血、水腫，病理檢查確認有慢性炎癥細胞浸潤、典型潰瘍形成等UC病理改變，說明造模成功[5]。在造模給藥過程中共有20只大鼠死亡。

1.4.4 給藥 將造模成功的大鼠隨機分為模型組(10只)、陽性藥物組(8只)、二神丸低劑量組(10只)、二神丸高劑量組(10只)。根據成人常規(guī)劑量按人與大鼠系數折算[6]，陽性藥物組予美沙拉秦緩釋顆?；鞈乙?.5 g/(kg·d)灌胃，二神丸低劑量組予二神丸水煎液1.575 g/(kg·d)灌胃，二神丸高劑量組予二神丸水煎液6.3 g/(kg·d)灌胃，正常對照組和模型組予等容積10 mL/(kg·d)蒸餾水灌胃，各組連續(xù)灌胃14 d。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 一般情況 每日觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、行為改變、皮毛光澤度及大便的性狀、便血、隱血情況，同時記錄大鼠每日的體質量變化情況。

1.5.2 全血PLT、平均血小板體積(MPV)測定 各組大鼠給藥14 d后禁食不禁水12 h，再用10%水合氯醛3.5 g/kg進行腹腔注射麻醉，麻醉后剖開腹腔，使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管吸取腹主動脈血，再采用全自動血液細胞分析儀檢測PLT、MPV水平情況。

1.5.3 血清P-selectin、NO測定 使用無添加劑的真空采血管取腹主動脈血，在4 ℃下以3000 r/min離心10 min，取上清液，P-selectin采用ELISA法進行檢測，NO采用硝酸還原法進行檢測，相關操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.4 結腸病理組織學觀察 各組大鼠取血后，剪取距肛門8 cm處的結腸組織4～5 cm，置于4%多聚甲醛液中固定48 h后進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，常規(guī)制作成石蠟病理切片，再行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察結腸病理組織學情況。

1.5.5 結腸組織TNF-α、IL-1β測定 各組大鼠取同一位置同一大小結腸段，迅速置于液氮中，-80 ℃超低溫冰箱保存，進行結腸組織TNF-α、IL-1β水平檢測。IL-1β采用ELISA法進行檢測，TNF-α采用化學發(fā)光法檢測，相關操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 正常對照組大鼠毛發(fā)光滑有光澤，精神狀態(tài)好，體質量平穩(wěn)增加，大便形狀正常。模型組大鼠毛發(fā)無光澤，拱背扎堆蜷臥，糞便稀，肛周和尾巴底部覆蓋有稀便，并伴有惡臭，體質量增加出現明顯減緩。陽性藥物組和二神丸低、高劑量組大鼠一般情況均較模型組有改善，陽性藥物組改善明顯，毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)較好，拱背扎堆蜷臥現象減少，肛門污穢隨時間延長而減少，體質量增加較模型組略有增加。各組大鼠灌胃期間體質量變化曲線見圖1。

圖1 各組大鼠灌胃期間體質量變化曲線

2.2 各組大鼠灌胃后全血PLT、MPV比較 與正常對照組比較，模型組大鼠灌胃后全血PLT增加(P<0.05)，MPV降低(P<0.05)。與模型組比較，二神丸低、高劑量組大鼠全血PLT均降低(P<0.05)，二神丸低劑量組大鼠MPV增加(P<0.05)，陽性藥物組大鼠全血PLT、MPV和二神丸高劑量MPV與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。二神丸低、高劑量組大鼠全血PLT、MPV組間略有高低，但比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠灌胃后全血PLT、MPV比較

2.3 各組大鼠灌胃后血清P-selectin、NO水平比較 與正常對照組比較，模型組血清P-selectin、NO水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥物組、二神丸低劑量組、二神丸高劑量組血清NO水平和二神丸高劑量組P-selectin水平均降低(P<0.05)，陽性藥物組和二神丸低劑量組P-selectin水平雖也有降低趨勢，但比較差異無統計學意義(P>0.05)。二神丸高劑量組大鼠血清P-selectin、NO水平雖略低于二神丸低劑量組，但組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠灌胃后血清P-selectin、NO水平比較

2.4 各組大鼠結腸組織IL-1β、TNF-α水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠結腸組織IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥物組、二神丸低劑量組、二神丸高劑量組大鼠結腸組織IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05)。二神丸高劑量組大鼠結腸組織IL-1β、TNF-α水平雖略低于二神丸低劑量組，但組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠結腸組織IL-1β、TNF-α水平比較

2.5 各組大鼠灌胃后結腸組織病理形態(tài)情況 正常對照組大鼠結腸黏膜完整，腺體排列規(guī)則，肌層結構正常。模型組大鼠結腸腺體結構異常，黏膜和黏膜下層大量炎癥細胞，并有潰瘍形成。陽性藥物組和二神丸低、高劑量組大鼠結腸黏膜部分缺損，結腸黏膜炎性浸潤、腺體受損較模型組明顯減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠灌胃后結腸組織病理形態(tài)情況(HE，×200)

3 討論

UC發(fā)病主要是由于外邪侵襲、五志失調、攝食失宜等，致使機體氣血虛弱，正氣不足，氣血流通不暢，進而使大腸傳導失司，血不歸經，離經之血溢于脈外，脂膜血絡受損而發(fā)病。UC的病機關鍵為脾腎兩臟虛損，《素問·陰陽應象大論》曰：“濕盛則濡瀉?！敝赋鲂篂a的病機為脾虛濕盛，但UC的病機不全在于脾虛?！毒霸廊珪ば篂a》中指出：“腎為胃關，開竅于二陰，所以二便之開閉，皆腎臟之所主，今腎中陽氣不足，則命門火衰……陰氣盛極之時，則令人洞泄不止?！蹦I為先天之本，脾為后天之本，脾陽有賴于腎陽的溫煦，若腎陽虧虛，則脾失溫煦，運化失司，發(fā)為泄瀉；同時因后天之精不能充養(yǎng)先天之精，影響機體代謝，故大腸濕濁之邪滯留，氣血雙虧，虛實夾雜。二神丸為治療脾腎虛寒泄瀉的傳統古方，并且其組成補骨脂、肉豆蔻也是常用的溫補脾腎藥對，在臨床上作為基礎方隨癥加減，應用廣泛。方中補骨脂能補命門之火，具有溫腎助陽、固精縮尿、溫脾止瀉的作用；肉豆蔻具有溫中行氣、澀腸止瀉之效。二藥相合具有溫脾暖胃、補腎固腸之功效。

UC的發(fā)病機制尚不明確，一般認為主要與遺傳、炎癥、免疫等因素有關[7]，其中炎性反應是UC發(fā)病和惡化的最主要因素，腸道中細胞炎癥因子與腸道黏膜功能狀態(tài)密切相關[8]。TNF-α是由活化的單核細胞分泌的細胞因子，具有多種生物活性作用，不僅能夠對抗腫瘤，同時能夠介導機體的急、慢性炎性反應，能夠聚集中性粒細胞，釋放炎癥介質，促進多種IL的合成，誘導炎癥因子浸潤于腸道組織內，加速腸上皮細胞的壞死[9-11]。IL-1β為促炎因子，由單核細胞、巨噬細胞產生，正常情況下體內IL-1β含量極低，當組織受到感染或損傷時，IL-1β水平明顯升高，并可分泌到細胞外與相應受體結合，促進白細胞募集并釋放更多的炎癥介質，產生級聯效應，發(fā)揮促炎作用[12-13]。IL-1β目前已成為治療全身和局部炎癥性疾病的重要靶標，可通過降低IL-1β活性，抑制炎性反應，從而達到治療UC的效果[14]。本研究結果顯示，模型組大鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β水平較正常對照組升高(P<0.05)，病理觀察也顯示黏膜和黏膜下層大量炎癥細胞，提示UC大鼠結腸組織中炎性反應活躍；陽性藥物組、二神丸低劑量組、二神丸高劑量組大鼠經相應干預治療后結腸組織IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05)，提示結腸腸道炎性反應得到緩解。

近年來多項研究顯示，PLT在UC的發(fā)病機制中起重要作用，患者病情活動時PLT會明顯升高[15-16]。PLT是血液中最小的無核細胞，起源于骨髓巨核細胞，其在止血、炎癥及損傷組織修復過程中起重要作用。多數UC患者血液處于高凝狀態(tài)，甚至出現血栓形成等腸外表現，而PLT在機體的凝血功能和腸道炎癥的發(fā)生過程中扮演著關鍵角色，當凝血功能發(fā)生異常時，血流速度減緩，可導致腸黏膜缺血壞死，部分有潰瘍發(fā)生，因此血液高凝狀態(tài)會加重潰瘍[17-19]。清·王清任《醫(yī)林改錯》言：“瀉肚日久，百方不效，是總提瘀血過多?！闭J為瘀血是導致UC發(fā)病及病情遷延難愈的原因，又是發(fā)展的結果，貫穿疾病始終。PLT也能反映UC的炎性反應情況，UC患者由于腸系膜血管內皮損傷，繼而暴露基底膜膠原誘發(fā)PLT激活，一方面PLT參與炎性反應過程，其參與炎性反應需要IL-1β信號和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體活化，靜息狀態(tài)下PLT可表達NLRP3、接頭分子，在活化狀態(tài)PLT中兩者共定位組裝成功能性NLRP3炎癥小體，形成半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1),產生IL-1β等炎癥因子，促進炎癥過程[20-22]；另一方面多種炎癥因子也可使PLT數量、形狀、功能發(fā)生改變，釋放大量生物活性物質及促凝分子和微粒，導致高凝狀態(tài)，甚至血栓形成，高凝狀態(tài)與炎癥發(fā)生互為因果[23-24]。目前，PLT異常在UC中的作用已引起了廣大研究人員的關注，PLT的升高和MPV下降等已作為UC活動性的觀察指標之一，也可作為評測UC患者腸鏡下完全或部分黏膜愈合的預測指標[25]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠全血PLT升高(P<0.05)，MPV下降(P<0.05)，這也與前文提到的研究結果一致；二神丸低、高劑量組經相應干預后全血PLT、MPV均較模型組有不同程度改善，其中二神丸低、高劑量組PLT和二神丸低劑量組MPV改善最明顯(P<0.05)，而陽性藥物組全血PLT、MPV較模型組均無明顯變化(P>0.05)，提示二神丸通過影響UC大鼠PLT、MPV，既可改善機體的高凝狀態(tài)，防止血栓形成，同時又避免高凝狀態(tài)下炎性反應的加重，從而發(fā)揮治療作用。

為進一步驗證PLT與UC的關系，我們又對與PLT活化密切相關的P-selectin和NO做了觀察研究。P-selectin是一種依賴PLT活化的顆粒外膜蛋白，它是選擇素家族的成員之一，是一種細胞黏附分子受體，在未被活化的PLT細胞膜表面P-selectin呈低表達或不表達。當PLT活化可引起α顆粒釋放，α顆粒膜與PLT細胞膜融合，從而使P-selectin表達于血小板表面膜上。當組織受損或炎癥侵襲時，IL等炎性介質誘導內皮細胞和PLT表面P-selectin表達升高，可促使炎癥細胞與腸黏膜毛細血管內皮細胞形成粘連，在介導炎癥細胞滲出至腸黏膜組織中起重要作用[26]。P-selectin表達水平也是PLT活化程度的標志，PLT活化可釋放多種炎癥因子，參與局部炎性反應，并導致白細胞向局部炎癥累及部位趨化聚集，呈持續(xù)惡性循環(huán)[27-28]。有研究報道顯示，活動期UC患者P-selectin水平明顯高于健康人及緩解期患者，與疾病發(fā)展關系密切[29]。NO是具有多種生理和病理功能的自由基，在炎性反應發(fā)展過程中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)可催化產生大量NO，NO與受體結合后引起腸道黏膜毛細血管舒張、血流淤積，引發(fā)微循環(huán)紊亂，PLT活化，導致和加重炎性反應，且UC病變黏膜中iNOS活性和NO濃度的增加與炎癥程度呈平行關系[30]。有研究報道顯示，活動性UC患者NO水平與PLT呈正相關，這提示NO與血小板聚集、血栓形成存在關聯，NO參與了UC的病理生理過程，可作為臨床判斷UC患者病變嚴重程度的指標之一[31]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清P-selectin、NO水平較正常對照組均升高(P<0.05)，提示PLT活化增強；陽性藥物組、二神丸低劑量組、二神丸高劑量組經相應干預后血清P-selectin、NO水平較模型組均有下降趨勢，其中陽性藥物組、二神丸低劑量組、二神丸高劑量組血清NO水平和二神丸高劑量組P-selectin水平降低顯著(P<0.05)，提示二神丸能夠降低血清P-selectin、NO水平，抑制PLT活化。

綜上所述，二神丸對UC大鼠具有確切的保護和修復作用，其作用機制可能是通過減少炎癥因子表達，降低局部炎性反應，降低PLT并抑制PLT活化，改善血液的高凝狀態(tài)，從而改善結腸黏膜組織的炎性損傷，而起到治療作用。但同時我們還應注意到，本研究中二神丸低、高劑量組對各指標的改善作用并沒有呈現明顯的劑量關系，分析其原因中藥復方作用機制復雜，不同的藥物濃度可能具有不同的療效，有關二神丸治療UC的最佳藥物濃度和其他可能的作用機制仍有待進一步研究。