超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定百合上的氯蟲苯甲酰胺殘留

龍 慧，李 明，龍家寰，黃文源，毛佳怡，段婷婷

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006)

百合(Liliumbrowniivar.viridulumBaker)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)的多年生草本植物，不僅觀賞價值較高，還兼具食用和藥用價值[1]。百合肉質(zhì)鱗片含有豐富的生物堿、淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和多種維生素及鈣、鐵等元素，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神和免疫調(diào)節(jié)的功效，主要用于治療虛煩驚悸、鎮(zhèn)咳祛痰及降膽固醇等，在食品、藥品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2-5]。對百合產(chǎn)量有影響的害蟲主要有地老虎、蠐螬、蚜蟲等，化學(xué)防治因防控成本低且防控效果佳等特點是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治病蟲草害的主要措施，在百合上登記的殺蟲劑僅有烯啶·吡蚜酮和氯氟·噻蟲胺，但部分農(nóng)戶可能會使用其他農(nóng)藥來防治害蟲。氯蟲苯甲酰胺是具有新型鄰酰胺基苯甲酰胺類化學(xué)結(jié)構(gòu)的廣譜殺蟲劑[6]，可高效作用于靶標(biāo)害蟲的魚尼丁受體，使害蟲停止取食、肌肉收縮僵直、昏迷直至死亡，從而達(dá)到防治害蟲的效果[7]。因其殺蟲活性高、速效性好，生產(chǎn)上被廣泛用于防治鱗翅目、雙翅目和鞘翅目等害蟲[8]，在蔬菜、水果、糧食作物上具有良好的防治效果[9]。氯蟲苯甲酰胺對地老虎和蠐螬等地下害蟲具有較好防效，但長期不科學(xué)的用藥可能會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)風(fēng)險，為保證百合的質(zhì)量安全，有必要建立快速高效的檢測方法來評價氯蟲苯甲酰胺在百合中的殘留量。

氯蟲苯甲酰胺的檢測分析方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、高效液相色譜法[11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[12-13]。QuEChERS前處理方法快速、高效、安全，被廣泛用于多種基質(zhì)中農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理[14]，目前未見采用QuEChERS-UHPLC-MS/MS測定百合上的氯蟲苯甲酰胺殘留的分析方法。本研究通過QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合UHPLC-MS/MS法，對百合中的氯蟲苯甲酰胺進(jìn)行快速有效地檢測，以期為百合質(zhì)量安全檢測及安全科學(xué)用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TSQ-Vantage超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS，美國Thermo Fisher公司)；C18色譜柱[100 mm×2.1 mm，2.1 μm，賽默飛科技(中國)有限公司]；CK2000型高通量組織研磨器(北京托摩根生物有限公司)；BSA224S-CW型電子天平(德國Sartorius公司)；ID5002C電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)；TG16-Ⅱ型臺式高速離心機(jī)(湖南平凡科技有限公司)；MS200多管渦旋混勻儀(杭州瑞誠儀器有限公司)；0.22 μm有機(jī)濾膜(美國Agela Technologies公司)。

氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(98%，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心)；分析純乙腈、無水硫酸鎂、氯化鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；分析純乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(Merck-Millipore公司)；分析純冰乙酸(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；色譜純乙腈(德國默克公司)；色譜純甲酸[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用電子天平準(zhǔn)確稱取氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.0102g(精確到0.0001g)，用色譜純乙腈分別配制成1000μg/mL的儲備液10mL，于4℃冰箱中保存。取氯蟲苯甲酰胺農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液1mL，定容至10mL得到100μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用色譜純乙腈稀釋制得相應(yīng)0.005、0.01、0.05、0.1、1、5和10μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取干百合和鮮百合樣品5.0g(精確至0.01g)于50mL離心管中，加入15mL水，渦旋1min，加入10mL 0.1%冰乙酸乙腈溶液，以1000r/min振蕩20min，加入1g氯化鈉、4g無水硫酸鎂，以1000r/min振蕩10min后，5000r/min離心5min。移取1.5mL上清液，注入含50mg PSA和150mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋2min，以5000r/min離心5min，過0.22μm有機(jī)濾膜，濾液用純凈蒸餾水1∶4(V/V)混勻至進(jìn)樣瓶中，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱(100×2.1 mm，2.1 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣盤溫度：10℃；進(jìn)樣量：25 μL；流動相采用二元梯度洗脫，流動相A為甲醇，流動相B為0.1 %甲酸水(V/V)；流動相及梯度洗脫條件如表1所示。

表1 流動相及梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離源模式為電噴霧離子化(electrospray ionization，ESI)；離子源極性為ESI+；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(SRM)，霧化氣為氮氣；鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb；噴霧電壓：3 200 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜質(zhì)量條件參數(shù)

1.5 回收率實驗

根據(jù)美國規(guī)定氯蟲苯甲酰胺在百合上的最大殘留限量為0.3mg/kg，因此分別在干百合和鮮百合中設(shè)置3個添加水平(0.05mg/kg、0.50mg/kg、1.00mg/kg)的氯蟲苯甲酰胺，每個添加水平5次重復(fù)，采用1.3節(jié)前處理方法進(jìn)行樣品前處理，以1.4節(jié)儀器及儀器條件進(jìn)行檢測分析，計算各添加水平下的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件分析

本文使用電噴霧離子源(ESI)多反應(yīng)監(jiān)測模式分析氯蟲苯甲酰胺，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式質(zhì)譜掃描，發(fā)現(xiàn)氯蟲苯甲酰胺在正離子模式下有更高的響應(yīng)，確定待測農(nóng)藥母離子后優(yōu)化S-leans射頻電壓。碰撞能量選擇響應(yīng)最高的離子作為定性離子并優(yōu)化碰撞能量，其中響應(yīng)最高的為定量離子。得到如表2的氯蟲苯甲酰胺質(zhì)譜參數(shù)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)效應(yīng)

按照1.2節(jié)方法得到氯蟲苯甲酰胺的溶劑標(biāo)，再分別取1.0mL氮吹近干后用鮮百合和干百合空白基質(zhì)以稀釋至1.0mL；制備0.005、0.05、0.01、0.10和0.50mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；在上述儀器條件下進(jìn)行測定，以定量離子峰面積(A)與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣濃度(mg/L)為Y/X作圖，得到氯蟲苯甲酰胺在百合基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明氯蟲苯甲酰胺的進(jìn)樣濃度與峰面積在上述區(qū)間呈線性相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：氯蟲苯甲酰胺溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5275561.23x+89219.06(R2=0.9958)；鮮百合中氯蟲苯甲酰胺基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2888795.9x+14970.3(R2=0.9995)；干百合中氯蟲苯甲酰胺基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3136403.8x+24491.6(R2=0.9991)；相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，表明在0.005～0.5mg/L濃度范圍內(nèi)，氯蟲苯甲酰胺的峰面積與溶液濃度的線性關(guān)系良好，符合農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留分析要求[15]。

2.3 方法的準(zhǔn)確度、精密度與靈敏度

添加回收試驗結(jié)果(表4)顯示：氯蟲苯甲酰胺在鮮百合中的平均添加回收率在82%～100%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.01%～7.09%之間；在干百合基質(zhì)中的平均添加回收率在96%～107%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.12%～2.37%之間，添加回收準(zhǔn)確度及精密度均符合農(nóng)藥殘留分析試驗的要求[15]。根據(jù)歐盟相關(guān)規(guī)定，以農(nóng)藥的最低添加標(biāo)濃度為定量限(LOQ)和檢出限(LOD)[16]，添加回收試驗顯示氯蟲苯甲酰胺的LOQ和LOD均為0.05mg/kg。

表4 氯蟲苯甲酰胺在不同樣品中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實際樣品檢測

基于本研究建立的方法檢測采集自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗地內(nèi)百合的氯蟲苯甲酰胺殘留，氯蟲苯甲酰胺在鮮百合、干百合中的最終殘留量均

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(QuEChERS-UHPLC-MS/MS)快速檢測百合中氯蟲苯甲酰胺殘留量的分析方法，該方法以0.1%冰乙酸乙腈為提取劑，PSA(N-丙基乙二胺)為凈化劑，試劑使用量少、成本低、高效快捷，而且準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度均能滿足殘留分析要求，可用于百合中氯蟲苯甲酰胺的殘留檢測。