外周血ctDNA在結(jié)直腸癌中的臨床篩查研究

馬玉紅，劉永瑛，趙良玉，辛國軍，唐媛媛,李玉珍

結(jié)直腸癌多指大腸癌，是當(dāng)代發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤[1]。早期因癥狀不明顯，多與肛裂、結(jié)腸炎等疾病混淆，導(dǎo)致錯(cuò)診、漏診，耽誤患者在最佳時(shí)間接受治療[2-3]。因此，早期診出是提高患者生存時(shí)間的重點(diǎn)。以往臨床多采用影像學(xué)檢測，但一些細(xì)小的病灶難以被發(fā)現(xiàn)[4]，普通的腫瘤標(biāo)志物靈敏度又較低[5]，活檢為有創(chuàng)手段，并不適用所有患者[6]，故尋求新的檢測手段是關(guān)鍵。外周血ctDNA是將腫瘤組織細(xì)胞釋放進(jìn)入血液中的DNA片段，能夠反映原發(fā)腫瘤組織的情況，攜帶有效的分子信息，臨床通過將外周血ctDNA進(jìn)行基因測序，達(dá)到反映患者體內(nèi)腫瘤基因突變的目的，能夠?qū)⑵渥鳛樵\斷結(jié)直腸癌患者的有效方式[7-8]。目前將該手段應(yīng)用于結(jié)直腸癌患者診斷的研究較少，且對其預(yù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行分析診斷的研究稀缺，為此，本研究分析了97例患者的臨床資料，旨在為該類患者今后的診治及監(jiān)測提供有效依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：回顧性分析2020年5月至2021年9月期間本院收治且行根治性手術(shù)的97例結(jié)直腸癌患者的臨床資料，對其進(jìn)行臨床及隨訪研究。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前由活檢及電子結(jié)腸鏡檢測證實(shí)且符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，符合手術(shù)相關(guān)指征；②符合《赫爾辛基宣言》中的倫理審查標(biāo)準(zhǔn)；③臨床資料完整；④病癥非轉(zhuǎn)移瘤。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并手術(shù)相關(guān)禁忌證；②合并其他惡性腫瘤；③合并原發(fā)腫瘤病灶未全部切除；④合并術(shù)前新輔助治療；⑤合并妊娠、哺乳期孕婦；⑥合并消化道腫瘤疾病史。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤組織免疫組化：取腫瘤組織進(jìn)行石蠟切片(厚度約4 μm)，烘烤后脫蠟并采用二甲苯、梯度酒精、磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。通過高-中-低火冷卻后繼續(xù)采用PBS液清洗3次。采用3%的過氧化氫抑制過氧化氫酶30 min，而后繼續(xù)采取PBS液清洗3次。采用5%的BSA培育0.5 h，滴入MLH1/MSH2/MSH6/PMS2抗體，放在適宜溫度下靜置，而后用PBS液清洗3次。清除PBS液后加入鏈霉親和素，適宜溫度下靜置10 min，用PBS液清洗3次，而后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液，在鏡下觀察5 min。清水洗凈后使用蘇木素染色，用鹽酸酒精分化后清水洗凈，脫水后封片待檢。玻片由本院的2～3名醫(yī)生進(jìn)行閱片，得出一致結(jié)果。

1.2.2 外周血CEA定量檢測：抽取所有患者術(shù)前1 d 及術(shù)后1個(gè)月的外周肘靜脈血3 mL標(biāo)本，3 000 r/min離心10 min后取上層血清待測，采用羅氏E601全自動免疫分析儀及配套試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.3 腫瘤組織基因檢測與外周血ctDNA基因測序：①獲取外周血ctNDA。②獲取白細(xì)胞DNA。③獲取組織DNA。④DNA片段化：將提取的組織及白細(xì)胞DNA經(jīng)過片段化收集100～250 bp片段，采用NEBNext dsDNA Fragments酶切打斷，使用OMEGA Gel Extraction回收純化。⑤文庫DNA構(gòu)建：采用Kapa Biosystems公司的KAPA HTP Library Preparation Kit試劑盒進(jìn)行操作。⑥D(zhuǎn)NA測序：DNA 的測序捕獲采用Roche 的雜交試劑盒 SeqCap EZ Library Kit 進(jìn)行，捕獲后的DNA文庫交由深圳市海普洛斯生物有限公司協(xié)助測序。⑦測序結(jié)果分析：數(shù)據(jù)整理后提取有用的堿基信息，對信息進(jìn)行質(zhì)控、有效整理及刪減，校正數(shù)據(jù)；整理信息，對變異信息進(jìn)行解釋。

2 結(jié)果

2.1 97例結(jié)直腸癌患者的一般資料：本研究97例結(jié)直腸癌患者中，男性61例、女性36例；平均年齡(62.58±10.36)歲；結(jié)腸癌患者為38例，直腸癌患者為59例；患者腫瘤分期集中在Ⅰ～Ⅱ期60例，集中在Ⅲ～Ⅳ期37例；有29例患者存在家族疾病史；有62例患者接受術(shù)后化療。

2.2 97例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織S-P免疫組化與基因檢測結(jié)果：97例患者S-P免疫組化檢測MLH1/MSH2/MSH6/PMS2蛋白結(jié)果與腫瘤組織基因測序同樣的基因位點(diǎn)結(jié)果一致，兩者檢測的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率均為100%，見表1。

表1 97例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織S-P免疫組化與基因檢測結(jié)果比較

2.3 97例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織基因檢測與外周血ctDNA基因測序結(jié)果：97例患者腫瘤組織TP53、APC、KRAS、PIK3CA基因位點(diǎn)測序提示，共發(fā)生突變87例，未突變10例；外周血基因測序結(jié)果提示突變77例，未突變20例，且突變的77例患者均在腫瘤組織測序中顯示突變，腫瘤組織測序突變有2例未檢出。外周血ctDNA基因測序的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率分別為88.5%、100%、89.7%，見表2。

表2 97例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織基因檢測與外周血ctDNA基因測序結(jié)果比較

2.4 結(jié)腸癌與直腸癌患者術(shù)前ctDNA含量比較：97例結(jié)直腸癌患者中，結(jié)腸癌患者59例，占比60.82%，直腸癌患者38例，占比39.18%，結(jié)腸癌患者術(shù)前每2 mL外周血ctDNA含量為(17.95±8.40)ng，直腸癌患者術(shù)前每2 mL外周血ctDNA含量為(11.73±5.39)ng。兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，直腸癌與結(jié)腸癌患者術(shù)前外周血ctDNA含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 術(shù)前外周血ctDNA與CEA診斷結(jié)直腸癌結(jié)果：術(shù)前外周血ctDNA診斷結(jié)直腸癌患者的靈敏度與準(zhǔn)確率均為76.3%。術(shù)前CEA檢測出19例患者的CEA水平超過閾值，靈敏度與準(zhǔn)確率均為19.6%。術(shù)前CEA檢測靈敏度與準(zhǔn)確率均顯著低于術(shù)前外周血ctDNA診斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 術(shù)前外周血ctDNA與CEA診斷結(jié)直腸癌結(jié)果比較

2.6 術(shù)后外周血ctDNA與CEA值檢測結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的情況：術(shù)后外周血ctDNA預(yù)測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的靈敏度為100%、特異度為78.4%、準(zhǔn)確率為80.4%；術(shù)后檢測外周血CEA預(yù)測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的靈敏度為33.3%、特異度為73.9%、準(zhǔn)確率為76.3%，見表4。

表4 術(shù)后外周血ctDNA與CEA值檢測結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的情況比較

3 討論

隨著人們生活方式及社會環(huán)境的變化，結(jié)直腸癌的發(fā)生率居高不下，且發(fā)病年齡下降，呈現(xiàn)一定的年輕化趨勢[10-11]。部分患者在疾病早期的癥狀并不顯著，一旦確診后多進(jìn)入中晚期，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量，故對結(jié)直腸癌進(jìn)行早期的診斷及治療是提高患者生活水平及生命周期的關(guān)鍵[12]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的病理學(xué)診斷已無法滿足臨床的要求，故尋求新的診斷方式是醫(yī)療行業(yè)急需解決的問題。ctDNA是一種新的“液體活檢”技術(shù)，常用于檢測微小的腫瘤病灶或評估腫瘤藥物治療情況[13]。而二代測序技術(shù)的發(fā)展為ctDNA的檢測提供了便利[14]，在本研究中，其應(yīng)用于結(jié)直腸癌的診斷中有較好的效果。

本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織基因測序的檢測結(jié)果與免疫組化檢測結(jié)果相同，診斷的準(zhǔn)確率均達(dá)到100%，這表明采用基因測序進(jìn)行結(jié)直腸癌診斷有很高的可行性。而后將外周血ctDNA基因測序結(jié)果與腫瘤組織基因測序結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)97例患者能夠檢查到至少一個(gè)與腫瘤組織相同的基因突變，外周血ctDNA測序的診斷敏感度為88.5%、特異度為100%、準(zhǔn)確率為89.7%。這個(gè)結(jié)果表明其對于診斷結(jié)直腸癌的效果較為科學(xué)，能夠有效應(yīng)用在臨床診斷中，故對于某些無法獲取腫瘤組織的患者及需要進(jìn)行反復(fù)活檢的患者來說，能夠使用抽取外周血的方式代替活檢[15]。本研究顯示，術(shù)前結(jié)腸癌患者外周血ctDNA含量顯著高于直腸癌患者，提示結(jié)腸癌患者外周血ctDNA基因突變的數(shù)量可能高于直腸癌患者，但該結(jié)論缺乏大量的已知研究證實(shí)，故不做詳細(xì)探究。除此之外，臨床用于診斷結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況的方式是定量檢測某些血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)量的改變，例如血清CEA、CA199水平等[16]，但該指標(biāo)可能因?yàn)楹喜⑵渌膊《磉_(dá)異常，故單獨(dú)進(jìn)行檢測的價(jià)值較低。本研究將外周血ctDNA作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用在結(jié)直腸癌患者術(shù)前術(shù)后的診斷中，并與CEA值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示外周血ctDNA的診斷靈敏度及特異度均為76.3%，顯著高于CEA值診斷。另外，外周血ctDNA檢測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的靈敏度及準(zhǔn)確率均明顯高于CEA，提示能夠?qū)⑼庵苎猚tDNA作為一種新的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于早期診斷及術(shù)后監(jiān)測腫瘤中。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者外周血ctDNA的檢測效果理想，能夠與腫瘤組織活檢相結(jié)合靈活運(yùn)用于臨床檢測中。采用外周血ctDNA評價(jià)腫瘤負(fù)荷的靈敏度及準(zhǔn)確性高于CEA值，提示在今后能夠?qū)⑵渥鳛榕R床診斷的依據(jù)，為患者預(yù)后做出有效評估。本研究存在樣本數(shù)量有限的問題，在今后的研究中將會進(jìn)一步擴(kuò)大樣本的數(shù)量，使研究結(jié)果更具說服力。