雙黃消渴顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

林 燕，張修齊，胡珊玲，余建平

(贛南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西 贛州 341000)

近年來，中醫(yī)治療消渴癥已經(jīng)越來越為患者所認(rèn)可，其在提高人體臟腑功能方面起到重要作用.與西藥相比較，長期服用中藥的患者副作用反應(yīng)輕微，且在糖尿病的治療方案上，中醫(yī)治療針對患者的分型對病情進(jìn)行針對性治療，以達(dá)到實(shí)施的安全性和有效性，能減少西藥副作用對患者的影響[1-7].雙黃消渴顆粒具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀的功效，組成包括黃芪、黃連、麩炒白術(shù)、赤芍、玉竹、甘草、荔枝核、法木通、白扁豆、烏梅、玄參等11味中藥組成，含有多種有效成分，主要用于糖尿病、肥胖、甲狀腺疾病、代謝綜合征等代謝性內(nèi)分泌疾病屬于氣虛、陰虛或者淤血阻絡(luò)患者.

補(bǔ)氣圣藥黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表之功效，可用于治療脾胃氣虛、中氣下陷、瘡瘍潰久不斂、浮腫尿少等癥.多項(xiàng)臨床觀察表明：對于糖尿病腎病黃芪及復(fù)方有顯著輔助治療作用，對三期患者也有明顯的效果[8-9].黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分，可顯著降低蛋白尿，改善腎臟病理損傷，對腎臟具有保護(hù)作用[10-12].《名醫(yī)別錄》云：黃連“止消渴”.現(xiàn)代研究表明，黃連具有良好的降糖效果，可通過多條途徑發(fā)揮抗糖尿病的作用[13-15].赤芍有保肝、降血糖、抗腫瘤等作用[16-19].為了保證藥品的安全性和有效性，本文對雙黃消渴顆粒進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.在2020年版《中國藥典》的基礎(chǔ)上，采用薄層色譜鑒別法和HPLC-ELSD法對雙黃消渴顆粒進(jìn)行定性鑒別和定量研究，建立雙黃消渴顆粒TLC薄層色譜的定性鑒別和HPLC-ELSD的含量測定方法，為產(chǎn)品質(zhì)量提供有力保障.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

JJ500電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)； TLC成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)；萬分之一分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)； ATS4自動(dòng)點(diǎn)樣器(瑞士CAMAG公司)；高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，型號：1260/1200).

1.2 試劑

乙腈和乙醇為色譜純試劑，液相用水為去離子水，三氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯等其他化學(xué)試劑為分析純.所用到的各味中藥對照藥材均購買自中國食品藥品檢定研究院.

1.3 分析樣品

雙黃消渴顆粒(6 g/袋，批號分別為(20191201，20191202，20191203)，均由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)提供.

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜對黃芪、黃連和赤芍的鑒別

2.1.1 黃芪鑒別

取4 g雙黃消渴顆粒，加30 mL水，先超聲30 min后再進(jìn)行離心20 min.取上清液用水飽和的正丁醇振搖萃取3次(3*20 mL)后合并正丁醇液，再用氨試液洗滌3次(3*20 mL)后棄去洗液，并再次合并正丁醇液.把蒸干后的殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試液備用.另取1 g黃芪對照藥材，加50 mL水后煮沸30 min，放冷，取上清液，同法制成黃芪對照藥材溶液備用.按雙黃消渴顆粒的配方，除去黃芪后剩下的10味藥材進(jìn)行煎煮，適量加入硅藻土，制成50 g的黃芪陰性顆粒，按上述方法制備得陰性對照液.吸取上述溶液各10 μL，以10 ℃以下三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(體積比為10∶20∶11∶5)的下層溶液為展開劑，展開后取出并晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃烘箱中加熱至斑點(diǎn)顯色清晰.如圖1所示，黃芪供試品色譜與黃芪對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照色譜結(jié)果表明無干擾發(fā)生.

圖1 薄層色譜圖

2.1.2 黃連鑒別

取1 g雙黃消渴顆粒，加30 mL水，先超聲20 min后再進(jìn)行離心10 min.用濃氨試液將上清液調(diào)節(jié)pH值至10，接著用三氯甲烷振搖提取2次(2*20 mL)，合并三氯甲烷提取液后蒸干得到的殘?jiān)蛹状?5 mL溶解，作為黃連供試液備用.另取0.1 g黃連對照藥材，加30 ml水，超聲處理20 min后進(jìn)行離心10 min.取上層澄清溶液，同法制成黃連對照藥材溶液備用.按雙黃消渴顆粒的配方，除去黃連后剩下的10味藥材進(jìn)行煎煮，制成50 g的黃連陰性顆粒.吸取上述液各1 μL，以甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨試液(體積比為6︰3︰1.5︰1.5︰0.5)為展開劑，放入濃氨試液飽和的展開缸內(nèi)預(yù)飽和30 min，展開后取出并晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視.如圖1所示，黃連供試品色譜與黃連對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照色譜結(jié)果表明無干擾發(fā)生.

2.1.3 赤芍鑒別

取4 g雙黃消渴顆粒，加30 mL水，先超聲30 min后再離心20 min.取上清液后蒸干，所得殘?jiān)铀? mL溶解后用棉花過濾.將濾液通過D101型大孔吸附樹脂柱(濕法裝柱，內(nèi)徑8 mm，柱高10 cm)，接著以100 ml水洗脫并棄去洗液，再以20%乙醇100 ml進(jìn)行洗脫.用甲醇1 ml將洗脫液蒸干后所得殘?jiān)芙?，作為赤芍供試液備?另取0.5 g赤芍對照藥材，加水50 ml，微沸30 min，放冷，取上清液，同法制成赤芍對照藥材溶液.吸取上述液各10 μL，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(體積比為40︰5︰10︰0.2)為展開劑，展開后取出并晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105 ℃烘箱中加熱至斑點(diǎn)顯色清晰.如圖1所示，赤芍供品色譜與赤芍對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn).

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge Shield RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)，條件見表1；柱溫和漂移管溫分別為40 ℃和70 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；所設(shè)檢測波長：230 nm；理論塔板數(shù)不低于2 000.

表1 流動(dòng)相梯度條件

2.2.2 對照液的制備

精確稱定黃芪甲苷對照品粉末適量，以甲醇為溶劑制備成 494 Mg·mL-1含黃芪甲苷的溶液.

2.2.3 供試液的制備

精密稱取10 g本品粉末，研細(xì)，置250 mL量瓶中.準(zhǔn)確移取100 mL配制好的含4%濃氨試液的80%甲醇溶液(取濃氨試液4 mL于100 mL的量筒中，再加80%甲醇至100 mL，簡稱混合液)加到具塞錐形瓶中，加熱回流60 min后放冷.用混合液補(bǔ)足減失的重量，濾過，準(zhǔn)確移取50 mL濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用水飽和正丁醇振搖提取6次(6*20 mL).合并正丁醇液后再用40 mL氨試液洗滌2次，合并上層液所蒸干的殘?jiān)?0%甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋定容，搖勻過濾取續(xù)濾液，即得所需供試液.

2.2.4 陰性液的制備

依照雙黃消渴顆粒的配方，對除黃芪后剩下的10味藥材進(jìn)行煎煮，制成50 g陰性顆粒后按照供試液的制備方法制備.

2.2.5 專屬性試驗(yàn)

將“2.2.3”項(xiàng)下供試液、“2.2.2”項(xiàng)下對照液和“2.2.4”項(xiàng)下陰性對照樣品溶液各取20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣.從圖2可以看出，陰性對照溶液色譜圖中在相應(yīng)位置無色譜峰，說明除黃芪甲苷外的其他藥材對芍藥苷的測定無干擾.

圖2 雙黃消渴顆粒高效液相圖譜(注：A.黃芪甲苷對照品溶液；B.陰性對照溶液；C.供試品對照溶液)

2.2.6 線性關(guān)系考察

用膠頭滴管吸黃芪甲苷的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照公式計(jì)算出稀釋倍數(shù)，以甲醇稀釋到494 μg·mL-1為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用刻度移液管分別精密量取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.8 mL、1 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液至6個(gè)1 mL的量瓶中，用甲醇定容后上下倒置搖勻，得到制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的五個(gè)不同濃度的黃芪甲苷溶液，濃度分別為14.82 μg·mL-1、29.64 μg·mL-1、44.46 μg·mL-1、74.1 μg·mL-1、118.56 μg·mL-1、148.2 μg·mL-1，測出峰面積(Y)，記錄色譜圖.設(shè)峰面積(Y)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，濃度(X)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，根據(jù)數(shù)據(jù)畫出坐標(biāo)圖，得到的線性回歸方程為InY=0.995 7×InX+0.481 5，相關(guān)系數(shù)R=0.999 4，表明黃芪甲苷濃度在此范圍內(nèi)，線性良好.

2.2.7 儀器精密度試驗(yàn)

將2.2.2對照液，在2.2.1條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，芍藥苷峰面積精密度良好(RSD為0.27%).

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號為20191202的雙黃消渴顆粒，以2.1.2方法制備供試液，在2.1.1條件下進(jìn)樣測定，并每隔2 h連續(xù)測定6次，精密度良好(RSD=0.29%)，表明供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號為20191202的雙黃消渴顆粒，按2.1.2方法制備平行試液6份，同在2.1.1條件下測定，芍藥苷含量的重復(fù)性良好(RSD=1.59%).

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取批號為20191202的雙黃消渴顆粒，準(zhǔn)確稱取9份樣品各5 g于250 mL量瓶中，加入適量對照品，按2.1.2方法制備供試液， 2.1.1條件下測定，平均加樣回收率為97.12%，RSD為1.41%，具體測定結(jié)果見表2.

表2 黃芪甲苷平均加樣回收率測定結(jié)果(n=9)

2.2.11 樣品測定結(jié)果

精確稱取3批雙黃消渴顆粒樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定并平行2份，計(jì)算樣品中黃芪甲苷的含量，所得結(jié)果見表3.

表3 不同批次雙黃消渴顆粒黃芪甲苷含量測定

3 討論

3.1 定性鑒別藥材選擇

參照2020年版《中國藥典》黃芪項(xiàng)下薄層鑒別方法，供試品沒有出現(xiàn)棕色的斑點(diǎn)，而在紫外燈下，沒有出現(xiàn)與對照色譜相應(yīng)的斑點(diǎn)，原因可能是供試品的制備方法與含量測定的供試品制備方法一致，樣品濃稠，不容易展開；參照2015年版《中國藥典》黃芪的薄層色譜鑒別方法，得到的結(jié)果顯示，薄層板中供試品的斑點(diǎn)顏色比藥材的斑點(diǎn)顏色淺，可能是點(diǎn)樣量太少導(dǎo)致斑點(diǎn)比對照品淺.除了斑點(diǎn)顏色不一樣外，Rf值也比較小，原因是飽和時(shí)間不足，斑點(diǎn)沒有完全分離，部分斑點(diǎn)還出現(xiàn)重疊.在黃連的薄層鑒別中，同樣參考了2020年版《中國藥典》黃連項(xiàng)項(xiàng)下薄層鑒別方法，結(jié)果顯示斑點(diǎn)大小、顏色深淺、位置、數(shù)量和Rf值都與藥典中的結(jié)果出現(xiàn)差異，且未達(dá)到顯4個(gè)以上相同顏色的熒光斑點(diǎn)的要求，原因可能是展開劑的組分和比例不適合黃連供試品的展開，所以通過各種考察確定新的展開劑.赤芍用2020年版《中國藥典》的方法制備，但沒有顯相同顏色的斑點(diǎn)，分析原因得，振搖不能使供試品中的芍藥苷溶解到乙醇中，使對照品色譜中沒有顯示出斑點(diǎn).而大部分的藥材因?yàn)闆]有出現(xiàn)與對照色譜中同樣的斑點(diǎn)或者出現(xiàn)陰性干擾，而沒有把這部分的薄層色譜納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中.薄層色譜是對藥材進(jìn)行鑒別，若時(shí)間允許可將所有藥材的薄層色譜方法摸索出來，使薄層色譜鑒別在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中更具有說服力.

3.2 含量測定成分選擇

按照2020年版《中國藥典》的方法制備，但方法繁瑣且效果不好.采用2015年版《中國藥典》的方法制備，方法簡單但效果不佳，參考文獻(xiàn)，改進(jìn)方法，但效果還是不佳.最后結(jié)合了2015年和2020年版的《中國藥典》的制備方法，最后得到的結(jié)果比之前的要好.通過對提取溶液、提取溶液的體積、提取方法、提取時(shí)間、萃取次數(shù)、等因素的考察，最終確定供試液加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液100 mL加熱回流，補(bǔ)足失重，過濾，取50 mL溶液蒸干，再用水飽和正丁醇萃取6次.由于黃芪甲苷的紫外吸收屬于末端吸收，采用紫外檢測器時(shí)容易受到干擾，色譜峰分離度差.而蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度高，重現(xiàn)性好，分離度好，對熱不穩(wěn)定和揮發(fā)性化合物有較高的靈敏度，能檢測到任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品，所以選用蒸發(fā)光散射檢測器.該顆粒易吸潮，回流蒸干后得到的產(chǎn)品含糖較多，后期提取時(shí)也會有相當(dāng)一小部分黃芪甲苷損失，所以在該配方顆粒中提取到的黃芪甲苷較少.為了提取到更多的黃芪甲苷，從取樣量、提取方法、提取溶液、萃取次數(shù)等進(jìn)行多方面考察，最終得到適合該顆粒的黃芪甲苷含量測定供試品制備方法.薄層色譜是一種定性鑒別，通過對藥品的雜質(zhì)的檢查來檢驗(yàn)藥品的純度，快速進(jìn)行藥品的鑒別，且操作簡便，樣品不被破壞.對于雙黃消渴顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，薄層色譜法可用于藥材的鑒別.而高效液相色譜中的主要優(yōu)點(diǎn)為高壓、高效、高靈敏度、分析速度快等.

3.3 方法評價(jià)

本試驗(yàn)建立了雙黃消渴顆粒中藥黃芪、黃連、赤芍的薄層色譜鑒別及其主要化學(xué)成分黃芪甲苷的含量測定方法.所建立的薄層鑒別方法和含量測定方法具有精密度高、重復(fù)性好和穩(wěn)定有效等特點(diǎn)，可用于雙黃消渴顆粒藥品的質(zhì)量控制.