大豆GmCBL7-2生物信息學(xué)及非生物脅迫表達分析

陳炯辛，張軍，馬婷婷，李銘楊，于海偉，李珊珊，蘭紅宇，翟瑩

大豆生物信息學(xué)及非生物脅迫表達分析

陳炯辛1，張軍2，馬婷婷1，李銘楊1，于海偉1，李珊珊1，蘭紅宇3，翟瑩1

（1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白（CBL）作為植物鈣離子信號感受器，在植物非生物脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。對大豆基因進行生物信息學(xué)分析及非生物脅迫下表達量的檢測。基因開放閱讀框全長639 bp，編碼一個含212個氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分子量24.4 kD，等電點4.56，屬于親水性蛋白。預(yù)測結(jié)果顯示，GmCBL7-2蛋白主要定位于細胞質(zhì)中，含有13個磷酸化位點。GmCBL7-2蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)模型中存在兩個Ca2+結(jié)合位點。GmCBL7-2蛋白與擬南芥AtCBL7蛋白親緣關(guān)系最近。表達量檢測結(jié)果顯示，在大豆幼苗中可以響應(yīng)干旱、高鹽及低溫脅迫，且對干旱脅迫的響應(yīng)更加顯著。

大豆；鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白；生物信息學(xué)；非生物脅迫

環(huán)境中的非生物脅迫（干旱、低溫和鹽堿等）會嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育。植物中的鈣信號通路廣泛參與植物非生物脅迫耐受機制。在非生物脅迫下，植物細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增加，通過Ca2+感受器與Ca2+的結(jié)合調(diào)控下游靶蛋白，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，促進植物對各種非生物脅迫的耐受性[1-2]。

鈣依賴磷酸酶B類似蛋白（Calcineurin B-like protein, CBL）是植物中Ca2+信號感受器的一種，它能夠與蛋白激酶（CBL-interacting protein kinases, CIPK）互作形成CBL-CIPK復(fù)合體，在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[3]。CBL蛋白家族成員一般具有不同數(shù)量的EF手型結(jié)構(gòu)域，負責(zé)與Ca2+結(jié)合[4]。擬南芥基因組中報道了10個CBL基因[5]。其中，被干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)表達[6]；能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透和干旱脅迫抗性[7]；AtCBL10與AtCIPK24形成蛋白復(fù)合體參與擬南芥的耐鹽性[8]。水稻中的10個CBL基因也能響應(yīng)非生物性脅迫，且轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出更強的耐鹽性[9]。紫花苜蓿通過調(diào)控根中鈣的積累增強轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽堿脅迫能力[10]。

大豆富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，也是良好的食用油原料。在我國，大豆依賴進口的情況較為嚴(yán)重。非生物脅迫是影響大豆產(chǎn)量的重要因素之一，提高國內(nèi)大豆品種抵抗非生物脅迫的能力可以有效緩解大豆依賴進口的情況。

研究發(fā)現(xiàn)，大豆和均受到多種非生物脅迫的誘導(dǎo)表達，過表達或能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽及抗旱性[11-12]。本研究從在線數(shù)據(jù)庫中獲得一個大豆CBL基因，對該基因進行生物信息學(xué)分析及非生物脅迫下基因表達量的檢測，為大豆非生物脅迫抗性基因的篩選提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

所使用的大豆種子（北豆9號）是由齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種研究室提供的。

1.2 生物信息學(xué)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載基因及蛋白氨基酸序列。在線網(wǎng)站NCBI ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）預(yù)測基因開放閱讀框。利用在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org）分析GmCBL7-2蛋白的分子量、等電點和親/疏水性。利用在線軟件PSORT（https://www.genscript.com/tools/psort）預(yù)測GmCBL7-2蛋白的亞細胞定位。在線網(wǎng)站NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測GmCBL7-2蛋白的磷酸化位點。利用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）構(gòu)建GmCBL7-2蛋白3D模型，進行3D結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用MEGA5軟件構(gòu)建CBL蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.3 非生物脅迫處理

挑選飽滿的大豆種子，均勻播撒在細沙和草炭土中（1∶1混合）。7d后將生根的大豆幼苗移入Hoagland營養(yǎng)液中進行水培，水培過程中每2～3d更換一次營養(yǎng)液。待幼苗第一片三出復(fù)葉展開后進行以下處理：分別將幼苗根部完全浸沒在含有20% PEG8000和200 mmol/L NaCl的Hoagland營養(yǎng)液中進行干旱和高鹽脅迫處理；4℃培養(yǎng)箱中進行幼苗的低溫脅迫處理。在處理前（0h）及處理后1, 2, 5, 10, 24h分別剪取0.1g大豆幼苗第一片三出復(fù)葉，取樣后于液氮中速凍并盡快轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存。

1.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA

使用Takara公司的RNAiso Plus試劑進行大豆葉片總RNA的提取，具體實驗操作參考產(chǎn)品說明書。提取的總RNA經(jīng)Novoprotein公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后于-20℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR

利用Primer 5軟件設(shè)計實時熒光定量PCR的引物。上游引物5′-TCTAGCATCAGAGACAGCCTTCAG-3′，下游引物5′-TCCATCATCAACGACGGACCTAC-3′。使用Novoprotein公司SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒進行實時熒光定量PCR，內(nèi)參基因、參數(shù)設(shè)置和體系均參照QIU等[13]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用Student's檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 GmCBL7-2基因及蛋白序列分析

基因（GenBank登錄號：XM003538711）及蛋白氨基酸序列如圖1所示。

圖1 GmCBL7-2基因及蛋白氨基酸序列

基因開放閱讀框全長639bp，編碼的蛋白質(zhì)含212個氨基酸，預(yù)測該蛋白相對分子量為24.4kD，預(yù)測等電點為4.56，化學(xué)式為C1108H1708N270O333S8，原子總數(shù)為3427個。GmCBL7-2蛋白平均親水系數(shù)為-0.106，表明該蛋白屬于親水性蛋白。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，GmCBL7-2蛋白無信號肽和核定位信號，屬于非分泌性蛋白，定位于細胞質(zhì)中（可信度94.1%）。蛋白在細胞內(nèi)的定位與細胞內(nèi)信號響應(yīng)過程相關(guān)。研究表明不同CBL蛋白在細胞內(nèi)的定位情況存在很大差異，例如擬南AtCBL1定位在細胞膜上，AtCBL2定位在液泡膜上，AtCBL3在細胞膜和液泡膜上均存在，而AtCBL4和AtCBL5在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中均存在[14]。磷酸化位點預(yù)測結(jié)果如圖2所示，GmCBL7-2蛋白含有絲氨酸磷酸化位點9個，蘇氨酸磷酸化位點3個及酪氨酸磷酸化位點1個，推測這些磷酸化位點的存在可能與蛋白的空間結(jié)構(gòu)、活性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)[15]。蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)預(yù)測模型如圖3所示，GmCBL7-2蛋白存在兩個Ca2+結(jié)合位點。

圖2 GmCBL7-2蛋白磷酸化位點預(yù)測

圖3 GmCBL7-2蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測（方框代表Ca2+結(jié)合位點）

2.2 植物CBL蛋白系統(tǒng)進化分析

將GmCBL7-2與已鑒定功能的GmCBL1，GmCBL7及擬南芥CBL蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示（圖4），GmCBL7-2蛋白與AtCBL7蛋白的親緣關(guān)系最近，它們可能具有類似的功能。報道顯示，AtCBL7蛋白與GmCBL7-2蛋白類似，也主要定位于細胞質(zhì)中，它可以調(diào)控擬南芥對硝酸鹽缺乏的響應(yīng)[16]。鑒于大豆中已鑒定了一個基因[12]，所以本研究中的基因命名為。

圖4 植物CBL蛋白系統(tǒng)進化樹

2.3 GmCBL7-2非生物脅迫下表達分析

以未處理（0 h）大豆幼苗作為對照，利用實時熒光定量PCR對在干旱、高鹽和低溫脅迫下的表達量進行檢測。如5所示，干旱處理后的表達量顯著升高，在處理1 h時表達量達到峰值，為對照組的49倍，處理24 h時表達量下降至對照組的1.4倍。高鹽處理后，表達量峰值出現(xiàn)在處理后2h，僅為對照組的2倍，在處理10～24h，表達量已經(jīng)低于對照組。低溫處理后，表達量在處理2h時達到峰值，為對照組的5倍，后下降，在處理5～10h表達量低于對照組，直到處理24h時表達量再次升高?；虮磉_量檢測結(jié)果表明，在大豆幼苗中可以響應(yīng)干旱、高鹽及低溫脅迫，且對干旱脅迫的響應(yīng)更加顯著。

圖5 GmCBL7-2在非生物脅迫下的表達

a：在干旱脅迫下的表達；b：在高鹽脅迫下的表達，c：在低溫脅迫下的表達；*和**分別代表差異達到顯著（P<0.05）和極顯著（P<0.01）

3 結(jié)論

大豆基因開放閱讀框全長639bp，編碼一個含212個氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分子量24.4 kD，等電點4.56，屬于親水性蛋白。GmCBL7-2蛋白主要定位于細胞質(zhì)中，含有13個磷酸化位點。GmCBL7-2蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)模型中存在兩個Ca2+結(jié)合位點，與擬南芥AtCBL7蛋白親緣關(guān)系最近。在大豆幼苗中可以響應(yīng)干旱、高鹽及低溫脅迫，且對干旱脅迫的響應(yīng)更加顯著。

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Bioinformatics and abiotic stress expression analysis ofin soybean

CHEN Jiong-xin1，ZHANG Jun2，MA Ting-ting1，LI Ming-yang1，YU Hai-wei1，LI Shan-shan1，LAN Hong-yu3，ZHAI Ying1

(1.College of Life Science and Agroforestry, Qiqihar University, Heilongjiang Qiqihar 161006, China; 2.Branch of Animal Husbandry and Veterinary of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Heilongjiang Qiqihar 161005, China; 3.Qiqihar Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Heilongjiang Qiqihar 161006, China）

Calcineurin B-like protein (CBL) act as calcium ion signaling receptor, which play an important role in plant abiotic stress and signal transduction.In this study, thegene from soybean was analyzed by bioinformatics and its expression level was detected under abiotic stress.The open reading frame ofwas 639 bp, encoding a protein containing 212 amino acids with relative molecular weight of 24.4 kD and isoelectric point of 4.56. GmCBL7-2 protein was a hydrophilic protein.The predicted results showed that GmCBL7-2 protein was mainly located in the cytoplasm and contained 13 phosphorylation sites.There were two Ca2+binding sites in 3D structural model of GmCBL7-2 protein.GmCBL7-2 protein is most closely related toAtCBL7 protein.The expression level ofin soybean seedlings showed thatcould respond to drought, salt and cold stresses, and the response to drought stress was more significant.

soybean；calcineurin b-like protein；bioinformatics；abiotic stress

2021-12-31

黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃（UNPYSCT-2017153）；齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2020041）

陳炯辛（1998-），男，陜西漢中人，學(xué)士，主要從事植物分子遺傳育種研究，c940149536@iCloud.com。

翟瑩（1982-），女，吉林吉林人，教授，博士，主要從事植物分子遺傳育種研究，fairy39809079@126.com。

S565.1

A

1007-984X(2022)05-0074-05