化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫吸附試驗在乙型肝炎 病毒血清學(xué)檢驗中的應(yīng)用

王娜娜 王婷婷

作者單位：264006 山東煙臺，煙臺業(yè)達(dá)醫(yī)院檢驗科

乙型肝炎（乙肝）是一種由于感染乙型肝炎病毒引起肝臟病變的傳染性疾?。?］，在臨床上較為常見，以惡心、食欲減退、肝功能異常、肝區(qū)疼痛等為主要臨床表現(xiàn)［2］。乙肝的潛伏期較長，且大部分患者在潛伏期內(nèi)的臨床癥狀并不明顯，因此對乙肝的臨床診斷有一定的難度，若患者未得到及時有效的治療，會向肝硬化、肝功能衰竭進展，因此對疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療十分重要?；颊咴诟腥疽腋尾《竞螽a(chǎn)生特異性抗體，故臨床上一般通過乙肝病毒血清學(xué)檢測進行診斷，其中實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）作為該疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖然具有較高的敏感度和檢出率，但存在檢測時間長、費用昂貴等不足［3］，因此需要尋找更加高效、準(zhǔn)確的檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和化學(xué)發(fā)光法均為臨床較為常用的檢測方法，在實際應(yīng)用中各有優(yōu)勢。本研究選擇本院2020年1—12月 接收的110例疑似乙肝患者作為研究對象，就上述兩種方法在乙肝病毒血清學(xué)檢驗中的效果進行對比分析，旨在為臨床診斷乙肝提供更加可靠的數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2020年1—12月本院收治的110例疑似乙肝患者作為研究對象，其中男性63例，女性37例；年齡25～73歲，平均（49.65±4.49）歲。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ① 因出現(xiàn)發(fā)熱、惡心、食欲不振、上腹部不適、肝區(qū)疼痛等癥狀而就診被疑診為乙肝者；② 認(rèn)知功能正常，自愿參與本研究者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ① 存在原發(fā)性血液系統(tǒng)疾病者；② 存在相關(guān)代謝系統(tǒng)疾病、癌癥者；③ 處于特殊時期（經(jīng)期、妊娠期或哺乳期）的患者；④ 存在可能影響檢驗結(jié)果的疾病者；⑤ 存在精神障礙者。

1.1.3 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（審批號：20210702），所有檢測均獲得患者或家屬的知情同意。

1.2 研究方法 在檢驗前1 d囑所有受檢對象從晚上至次日清晨維持空腹?fàn)顟B(tài)至少8 h，采集受檢對象的空腹肘靜脈血5 mL，放置在真空分離膠試管中。以3000 r/min進行離心處理，時間為10 min，將分離出的上層血清保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.1 化學(xué)發(fā)光法 采用Sysmex HISCL-5000全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（日本希森美康株式會社）及原裝試劑乙肝病毒定量試劑盒，對血清標(biāo)本進行檢測，嚴(yán)格按照相關(guān)說明書進行操作。

1.2.2 ELISA 采用煙臺艾德康生物科技有限公司生產(chǎn)的ELISA 400全自動酶聯(lián)免疫分析儀以及北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供的ELISA測定試劑盒進行ELISA檢測。試劑盒在室溫條件下放置30 min，設(shè)置陽性、陰性及空白對照孔，于陽性、陰性對照孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)液50 μL，再加入50 μL特異酶，完成封膜處理后，使用振蕩器將液體混合均勻。 于37 ℃水浴箱中放置樣本，孵育30 min后清洗反應(yīng)板，在顯色后加入終止液。采用ELISA 400全自動酶聯(lián)免疫分析儀對血清中的乙肝核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb）、乙肝e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝e抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙肝表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）進行比色，記錄檢測結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) ① 觀察兩種方法在不同血清HBsAg濃度下的敏感度。② 觀察兩種方法的乙肝病毒陽性檢出率。HBcAb、HBeAg的正常參考值均為檢測標(biāo)本的吸光度值/臨界值（樣本A值/ cut off值，S/CO）＜1；HBeAb為S/CO＞1；HBsAb正常參考值為0～10 U/L；HBsAg正常參考值為0～ 50 U/L。判定標(biāo)準(zhǔn)為測量值不在參考值范圍內(nèi)則判定為陽性，反之則為陰性。③ 比較兩種方法的乙肝病毒血清學(xué)檢驗結(jié)果。④ 從110例患者的血清中選取35份高、中、低濃度HBsAg陽性血清進行重復(fù)性試驗，1日1次，計算批內(nèi)、批間重復(fù)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測不同血清HBsAg濃度的敏感度比較 不同血清HBsAg濃度下的ELISA檢測敏感度均明顯低于化學(xué)發(fā)光法（均P＜0.05）。見表1。

表1 化學(xué)發(fā)光法和ELISA對不同血清HBsAg濃度的檢測敏感度比較

2.2 兩種方法檢測乙肝病毒的陽性檢出率比較 110例受檢的疑似乙肝患者中，化學(xué)發(fā)光法的乙肝病毒檢出率明顯高于ELISA〔86.36%（95/110）比 63.64%（70/110）〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝15.152， P＜0.001）。

2.3 兩種方法檢測乙肝病毒的結(jié)果比較 化學(xué)發(fā)光法對HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAg、HBeAb的檢驗結(jié)果均明顯高于ELISA（均P＜0.05）。見表2。

表2 化學(xué)發(fā)光法和ELISA對乙肝病毒的血清檢驗陽性檢出率比較

2.4 兩種方法的批內(nèi)與批間重復(fù)性比較 兩種方法批間不同濃度HBsAg重復(fù)性均高于批內(nèi)檢測結(jié)果；ELISA批內(nèi)不同濃度HBsAg均高于化學(xué)發(fā)光法，批間低濃度、中濃度比化學(xué)發(fā)光法高，即ELISA重復(fù)性高于化學(xué)發(fā)光法。見表3。

表3 化學(xué)發(fā)光法和ELISA對不同血清HBsAg濃度的檢測重復(fù)性比較

3 討論

乙肝是一種發(fā)生率較高且傳染性較強的疾 ?。?］，乙肝病毒具有一定的耐高溫性，容易經(jīng)母乳喂養(yǎng)、輸血、生活接觸等多種途徑傳播。近年來，隨著我國乙肝防控工作的深入開展，該疾病的發(fā)生率有所下降，但仍具有較大的發(fā)病基數(shù)，因此還需進一步加強防控工作。同時乙肝病毒篩查也是婚前和孕前檢查的常規(guī)項目之一，當(dāng)受檢者HBsAg呈陽性時，會增加其配偶及子女的乙肝病毒感染風(fēng)險，并可能對母嬰結(jié)局產(chǎn)生不利影響，故加強婚前和孕前檢查對于控制乙肝病毒的傳播具有重要作用。乙肝長期遷延不愈會導(dǎo)致肝硬化和肝癌等并發(fā)癥的發(fā)生［5］，進而威脅患者的生命安全，且由于目前臨床上尚無治療該疾病的特效藥物或方法，即使在患者得到有效治療后仍會攜帶乙肝病毒，因此定期篩查、保持隨訪意義重大。

乙肝的早期癥狀不典型，僅憑臨床癥狀進行診斷易出現(xiàn)漏診、誤診。選擇何種診斷措施，科學(xué)有效地提高乙肝病毒陽性檢出率是臨床乙肝研究中的重點課題，且早期篩查能避免進一步引起并發(fā)癥和其他器官損傷。在感染乙肝病毒后，能夠在大部分受檢對象的血清中檢測到HBcAb，其是乙肝血清學(xué)標(biāo)志物中敏感度較高的一種［6］。HBcAb在血清中存在時間長，可用于判斷早期急性乙肝病毒感染。HBeAb的出現(xiàn)提示機體中的乙肝病毒復(fù)制數(shù)量逐漸減少或停止；而在HBeAb呈陽性的患者中，乙肝病毒DNA檢測結(jié)果為陽性，提示機體內(nèi)的病毒正處于大量復(fù)制階段，故需要及時給予抗病毒治療，反之則提示傳染性較弱。同時部分患者的HBcAb滴度高，且在HBsAg為陰性時，受檢者的血清中能夠檢測到HBcAb，故HBcAb滴度高對于判斷機體是否感染乙肝病毒具有一定作用。HBeAg主要反映乙肝病毒的復(fù)制情況，當(dāng)HBeAg超過正常參考值范圍，則說明病毒復(fù)制數(shù)量多且具有較強的傳染性［7］。HBeAg一般在機體感染乙肝病毒后2～6個月內(nèi)可以在患者血清中檢出。HBsAb屬于保護性抗體，是機體為HBsAg產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性抗體，可在機體感染乙肝病毒后6～23周內(nèi)被檢測出，并在患者體內(nèi)長期存在，當(dāng)HBsAb呈陽性時，提示機體已獲得免疫。HBsAg可在乙肝患者的血液、分泌物中檢出，早期急性乙肝病毒感染患者中會從HBsAg陽性向陰性轉(zhuǎn)變，在慢性乙肝患者中則HBsAg一直為陽性。

乙肝五項指標(biāo)是乙肝診斷的敏感性標(biāo)志物，目前多采用化學(xué)發(fā)光法、ELISA進行檢測，均具有操作簡單、價格低廉的優(yōu)點［8］。ELISA是指將使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面產(chǎn)生固相抗原或與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，并保持其免疫活性，能將未結(jié)合的抗原清除，根據(jù)顯色不同對抗原和抗體的陽性情況進行判定。ELISA適用于大批量樣本的檢測，但在臨床實際工作中容易出現(xiàn)樣本污染的情況，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，造成臨床實際檢驗需求無法得到滿足［9-10］。

化學(xué)發(fā)光法屬于分子發(fā)光光譜分析法，是利用儀器對體系化學(xué)發(fā)光強度的檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法，與其他發(fā)光分析法的本質(zhì)區(qū)別在于體系產(chǎn)生發(fā)光（光輻射）所吸收的能量來源不同?；瘜W(xué)發(fā)光法利用自動化儀器進行檢測，具有較高的自動化和標(biāo)準(zhǔn)化水平，檢測結(jié)果不易受到外界因素的干擾，可減少人工操作產(chǎn)生的誤差，并且可使電磁消失速度加快，促進復(fù)合、游離抗體的分離，在乙肝病毒標(biāo)志物定量檢測中的敏感度高，并可動態(tài)監(jiān)測乙肝病毒感染［11-12］。同時化學(xué)發(fā)光法所用試劑消耗量低、穩(wěn)定性高、易儲存，適合在臨床 中推廣。本研究結(jié)果顯示，與ELISA比較，化學(xué)發(fā)光法對不同血清HBsAg濃度下的檢測敏感度、陽性檢出率以及血清乙肝五項指標(biāo)的檢出率均更高，充分說明了化學(xué)發(fā)光法具有較高的敏感度和特異度。分析原因在于，ELISA無法對疑似乙肝病毒感染者的復(fù)制情況和感染程度進行判斷。在無償獻(xiàn)血者等乙肝病毒感染率較低的人群中更容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果［13］。 另外，國內(nèi)不同廠家生產(chǎn)乙肝ELISA試劑盒的截止計算方法、檢測一致性均存在較大差異，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。在臨床實驗室檢測中，需要先對試劑盒是否完全符合要求進行評估，完全符合的試劑盒才可使用，以降低假陽性率。化學(xué)發(fā)光法借助全自動儀器和配套試劑，可減少人為因素對檢測結(jié)果造成的影響［14］，實現(xiàn)了檢測的標(biāo)準(zhǔn)化、自動化、科學(xué)化，從而可提升檢測的準(zhǔn)確度，獲得更加穩(wěn)定的檢測結(jié)果，直接確定抗體、抗原的含量或濃度，減少誤診、漏診情況的發(fā)生［15-16］。同時化學(xué)發(fā)光法具有診斷范圍廣、時間短、分析方法簡單等優(yōu)勢，雖然可能會出現(xiàn)漏診，但乙肝病毒的檢出率仍較高［17］。劉靜等［18］研究表明，化學(xué)發(fā)光法的HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBsAb、HBsAg陽性檢出率均高于ELISA，提示化學(xué)發(fā)光法更具推廣應(yīng)用價值，所得結(jié)果和結(jié)論與本研究相似，佐證了此次研究結(jié)果具有較高的真實性和可靠性。與同類型研究進行比較，本研究還進一步探究了不同血清HBsAg濃度下的檢測敏感度，結(jié)果顯示化學(xué)發(fā)光法對乙肝病毒檢測的敏感度較高。本研究不足之處在于，未進一步對對檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度、敏感度等進行評估，應(yīng)在今后加強此方面的研究。 綜上所述，化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用于乙肝病毒血清學(xué)檢驗中的臨床價值高于ELISA，適合在臨床中進一步推廣使用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突