神奇的數(shù)字全息顯微鏡

何炳恩 龔湘君

從光學顯微鏡到電子顯微鏡，人類觀察微觀世界的努力從未停下過腳步。光學顯微技術(shù)作為一種快速無損的表征方法，可獲得微米尺度觀察對象的圖像信息，應用范圍極為廣泛；電子顯微鏡則以高速運動的電子為介質(zhì)，通過電子束“看清”更小的觀測樣品。但無論是光學顯微鏡還是電子顯微鏡，獲得的都只是平面圖像。數(shù)字全息顯微鏡是一種新型的光學三維成像途徑。

從火把到電燈，人類利用光的身影始終出現(xiàn)在文明的發(fā)展歷程中。但對光本質(zhì)的認識，卻不那么一帆風順。早在17世紀，牛頓便在其所著的《光學》中提出光是一種高速運動的微粒流，但這個說法并不能解釋日常生活中所見的某些現(xiàn)象。在同一時期，荷蘭物理學家惠更斯提出了光的波動說，但由于理論尚不完善及牛頓的影響力，該學說并未得到大眾認可。

1801年，托馬斯·楊做了著名的雙縫干涉實驗。他將一束單色光照射在兩條平行且足夠狹窄的細縫上，細縫后方的屏幕上顯示出若干條明暗相間的條紋，這種現(xiàn)象即為干涉。光的波動說能較好地解釋干涉現(xiàn)象。把光想象成水面上的波紋，它在向遠處擴散的同時進行著上下往返的波動。從原理上分析得知，光照射在狹縫上，實際上形成了兩束相干光，它們到屏幕上任意一點的距離并不相同，當這兩束光在該點相遇時，它們的波峰和波谷位置并不一致。二者進行疊加，其波動的抵消與加強便形成了明暗條紋。日常生活中，干涉現(xiàn)象隨處可見，如肥皂泡上五彩斑斕的條紋，正是光發(fā)生薄膜干涉的緣故。

光是一種電磁波，它的傳播有著一個往返振動的相位。但與能輕易觀測的水面波紋不同，光的相位變化實在太快，達到1014赫量級，而常規(guī)的相機記錄頻率不過是數(shù)十到數(shù)百赫茲，根本來不及記錄相位變化的過程。因此，通常只能獲得光場振幅的平均值即光強，而無法獲得其相位信息。

干涉條紋可以反映光的相位信息，根據(jù)干涉現(xiàn)象反向推算出光場相位信息的方法就是全息術(shù)。全息術(shù)譯自英語holography，顧名思義，表示同時獲得光的全部信息，包括光強及相位信息。它最早由英國倫敦帝國科技學院的匈牙利裔物理學家伽博（D. Gabor）在1947年提出[1]。他發(fā)現(xiàn)在使用單色光照射物體時，可以利用干涉現(xiàn)象將光的相位信息保留在記錄介質(zhì)上，用相同的光照射記錄介質(zhì)時可以重新獲得物體的光場信息。伽博使用化學膠片記錄下了首張全息圖并發(fā)展了全息攝影技術(shù)，由此獲得1971年諾貝爾物理獎。

全息術(shù)在出現(xiàn)之初并不惹人注目，因為它在實際使用中效果并不理想。當時作為光源的汞燈相干性較差，超細微粒銀鹽全息干版需要長時間曝光才能記錄全息信息，而后還需要在暗室進行顯影、定影、漂白等一系列處理，才能獲得一幅全息圖像。進行全息記錄需要極其穩(wěn)定的條件，且時間和材料成本較高，這些缺陷限制了全息術(shù)的發(fā)展。

早期的全息術(shù)中，物光與參考光方向一致，這就是同軸全息。同軸全息獲得的全息圖在還原光場信息時會產(chǎn)生一個與物像重疊的共軛虛像，故在相位的還原上存在較大問題。為解決該問題，1962年，美國密歇根大學的利思（E. Leith）和烏帕特尼克斯（J. Upatnieks）提出離軸全息[1]。他們將通信理論中的載頻概念推廣到空域中，實現(xiàn)了實像與共軛虛像之間的分離。離軸全息引入一個微小的傾角，令物光與參考光的傳播方向不完全一致，形成的全息圖在頻譜中可以區(qū)分物像和共軛虛像，進而能以濾波的方式規(guī)避共軛虛像的疊加，解決了同軸全息方法中難以進行的相位計算問題，使得利用單張全息圖像計算相位成為可能。

1960年代，激光發(fā)生器的出現(xiàn)為全息術(shù)提供了一種穩(wěn)定且高度相干的光源，極大提高了全息精度的上限。另一方面，電子成像設備及計算機的發(fā)展為全息術(shù)的數(shù)字化創(chuàng)造了條件。1967年，古德曼（J. W. Goodman）和勞倫斯（R. W. Lawrence）使用由計算機控制的相機進行了全息圖像的記錄。他們以氦氖激光器為光源，用相機記錄了一張256×256像素的八級灰度圖，并使用計算機算法對獲得的圖像進行二維傅里葉變換操作。通過對比數(shù)字計算結(jié)果與純光學方法圖像，他們證實了使用相機和計算機進行數(shù)字記錄及計算重建被記錄對象的可行性，為之后數(shù)字全息計算的蓬勃發(fā)展打下堅實基礎。

1994年，施納斯（U. Schnars）和于普特納（W. Jüptner）實現(xiàn)了全息術(shù)的全面數(shù)字化，全息術(shù)的研究由此進入新階段。他們使用電荷耦合器件（chargecoupled device， CCD）相機對一顆骰子全息記錄，并使用計算機算法進行數(shù)字重建，成功還原出骰子的光強圖像。相比需要在暗室沖洗膠片的傳統(tǒng)光學全息術(shù)，數(shù)字全息術(shù)在使用便捷性上擁有壓倒性優(yōu)勢。

數(shù)字全息顯微鏡（digital holographic microscope）是利用光的干涉現(xiàn)象提取樣品三維信息的光學測量裝置。它結(jié)合了光學顯微成像及數(shù)字全息技術(shù)，把平面成像時失去的反映高度的相位信息保留在干涉條紋中，由相機對其進行記錄，并通過后續(xù)計算模擬光在空間中的傳播，重建包含目標在內(nèi)的特定三維空間內(nèi)的光場，從而實現(xiàn)對樣品表面的準三維成像。數(shù)字全息顯微鏡在多年發(fā)展中逐漸拓展出多種應用，應用成熟度最高的有微粒三維運動的追蹤和三維形貌的表征成像。

微粒追蹤

同軸數(shù)字全息顯微鏡具有快速成像的優(yōu)點，可追蹤空間中微粒三維運動，這是傳統(tǒng)全息技術(shù)難以實現(xiàn)的。它先通過樣品微粒的散射光和周邊空白區(qū)域發(fā)生干涉所形成環(huán)狀的干涉條紋，得到全息圖像；再根據(jù)光場的衍射理論，對全息圖像進行數(shù)值重建計算，從而獲得物光在三維空間分布。通過對聚焦位置的判定，同軸數(shù)字全息顯微鏡能極其準確地獲得微粒樣品在空間中的位置信息，其精度甚至能突破衍射極限的限制[2]。

由于同軸數(shù)字全息顯微鏡在觀測中，不需要進行染色等影響生物活性的制樣過程，因而特別適用于研究微生物和顆粒在溶液及界面附近的運動行為。筆者課題組使用同軸數(shù)字全息顯微鏡對大腸桿菌的運動軌跡進行了追蹤（細菌培養(yǎng)在一個逐漸降解的表面上），觀測并獲得大腸桿菌在該表面附近的運動方向、速度、趨勢等參數(shù)，進而分析該類表面針對微生物的動態(tài)防污效果[3]。此外，課題組還對電場中大腸桿菌的三維運動進行了監(jiān)測。通過分析大腸桿菌在不同周期的電場中運動狀態(tài)的差異，揭示大腸桿菌黏附行為與電場周期之間的聯(lián)系，為利用電場進行廢水處理和海洋防污提供了新思路[4]。

除了能確定微粒位置，同軸數(shù)字全息顯微鏡還能還原微粒大小和形態(tài)，為進一步分析其表面的微觀變化做好前期工作。2020年，斯奈德（K. Snyder）等人應用全息顯微技術(shù)研究抗體與抗原的結(jié)合[5]。他們在聚苯乙烯微球表面修飾上抗原蛋白，并將微球分別加入兩種不同抗體的溶液中，基于洛侖茲—米氏（Lorenz-Mie）光散射理論對全息圖像進行擬合計算，獲得微球直徑的變化情況，進而推斷抗體在小球表面的覆蓋情況，為抗體濃度、微觀結(jié)合機理等方面的分析提供參考依據(jù)[5]。

形貌表征

傳統(tǒng)的光學顯微鏡僅僅能平面成像，無法獲得高度信息，而數(shù)字全息顯微鏡卻能通過對光場信息的還原計算出光程差，進而獲得樣品的三維形貌。最早，全息術(shù)僅能對光強進行一定的還原而無法獲得三維形貌，原因是存在共軛虛像的干擾。為解決此干擾問題，不同的光學設計方式被提出并各自發(fā)展壯大。

最容易實現(xiàn)的是上文提到的利思等人提出的離軸全息方法。隨著頻域濾波等算法及硬件條件的提升，離軸數(shù)字全息顯微鏡的空間精度有大幅提升，已達到納米級。2008年，瑞士一課題組使用離軸數(shù)字全息顯微鏡對在石英基片上用鉻蒸鍍的微臺階表面形貌（高約8.9 納米）進行了三維測量，實現(xiàn)了高精度的三維形貌觀測[6]。他們分別使用波長分別為657納米和680納米的兩種光源進行觀測，發(fā)現(xiàn)二者在還原結(jié)果上差距較小，且計算獲得的橫截面高度與其他儀器標準獲得標準值的差距在誤差范圍內(nèi)。

由于離軸數(shù)字全息顯微鏡能夠?qū)悠返膭討B(tài)過程進行三維無損觀測，故適合用于細胞相關(guān)的生物樣品研究，如拉帕茲（B. Rappaz）等人使用離軸數(shù)字全息顯微鏡對野生型及突變型酵母細胞的分裂周期進行了成功觀測[7]。此外，還有研究者利用它對阿米巴變形蟲、海拉細胞、人體紅細胞等多種樣品進行了三維成像及研究。綜上，離軸數(shù)字全息顯微鏡由于能復原物體或表面精細的相位形貌，可廣泛應用于生物細胞的檢測領域。

除離軸全息外，研究人員還提出了相移全息。1969年，克蘭（R. Crane）首次明確提出相移干涉測量的概念。相移數(shù)字全息顯微鏡是一種結(jié)合全息顯微及相移干涉技術(shù)的裝置，通過多幅攜帶一定相移量的干涉圖像獲取待測物光波前的相位分布。使用時，先通過對參考光調(diào)制，改變相干光之間的相位差，獲得一系列全息圖像。之后，通過對這些全息圖像進行計算，獲得物光的相位信息，進而獲得樣品表面的三維形貌。

由于相移數(shù)字全息顯微鏡獲得三維形貌得基于多張全息圖像，因此需要對靜止樣品多次成像或使用多臺相機對同一樣品成像。前者是較常見的做法，使用的是時間相移數(shù)字全息顯微鏡，先在相位差隨時間進行移動的情況下用一臺相機進行成像，不同時間的圖像組成一組相移全息圖像，進而計算出樣品三維圖像。這一類裝置光路相對簡單，相移控制也較靈活，因此在研究使用上相對廣泛。但由于時間相移數(shù)字全息顯微鏡要求相移前后樣品不變，故只適用于靜止或準靜止樣品，如電子元器件等。對于動態(tài)變化過程，有人研制出空間相移數(shù)字全息顯微鏡，使用多臺相機或同一相機的不同位置進行記錄，以獲得同一時間下樣品在不同相移量下的全息圖像。這種裝置能實現(xiàn)動態(tài)觀測，但對光路設計和硬件配置的要求很高。2004年，日本科學家粟辻安浩（Y. Awatsuji）等人通過掩膜板技術(shù)在相機前加入了相移陣列，使得同一相機上各部位的相移量不同，實現(xiàn)了多幅相移全息圖像的同時記錄[8]。

通過光源的調(diào)制，也能實現(xiàn)相位的獲取。2019年，張賀等人發(fā)表的關(guān)于近場傅里葉疊層成像研究的論文[9]，講述他們用散斑照明代替原本均勻的光照，通過散斑與樣品之間的相對運動實現(xiàn)干涉狀態(tài)的變化，進而利用多幅低分辨圖像計算出樣品的光強及相位信息，并較大幅度提升了所獲圖像的分辨率。

除去成像光路上的修改，開發(fā)算法推算同軸全息中光場的相位信息也是研究重點。早在1970年代，英國劍橋大學的格奇伯格（R. W. Gerchberg）和薩克斯頓（W. O. Saxton）就提出格奇伯格—薩克斯頓（Gerchberg-Saxton）算法（簡稱GS算法）來恢復成像過程中丟失的相位信息。其他研究人員在此基礎上，發(fā)展出Fienup法等改良方法。這類方法與之前提及的直接計算的全息術(shù)不同，是通過代入估計值進行迭代逼近真實值來獲取相位信息，對計算機算力、圖片質(zhì)量等要求較高。

近年來，隨著相機成像精度和計算機算法及運行速度等多方面的提升，結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定性高的同軸全息再次受到重視。如美國加利福尼亞大學研究組在同軸全息顯微鏡的基礎上引入發(fā)光二極管（lightemitting diode， LED）陣列，在不加入透鏡的情況下，通過計算機算法實現(xiàn)了超分辨率成像[10]。他們使用該裝置對感染了瘧疾寄生蟲（惡性瘧原蟲）的紅細胞進行成像，寄生蟲在無透鏡顯微鏡的振幅和相位圖像中均清晰可見。

數(shù)字全息顯微鏡作為一種快速定量三維成像方法，使我們在不需要對樣品進行過多處理的情況下，實現(xiàn)對微粒的實時三維觀測，獲取其空間三維信息隨時間的變化過程。目前，它已廣泛應用在微粒表征、生物樣品檢測等科研領域。

盡管全息術(shù)仍受到相機分辨率、激光散斑等因素影響，但隨著光路的創(chuàng)新與優(yōu)化、算力的提升、圖像處理和深度學習算法等蓬勃發(fā)展、激光調(diào)制技術(shù)的改良，以及相機在精度及采集速度上的突破，相信在不久的將來，這項技術(shù)將會更加完善。它與其他技術(shù)相結(jié)合，會在微觀領域的研究與檢測中綻放獨特光彩，成為促進科學研究的利器。

[1]Schnars U， Ptner W. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Measurement Science and Technology， 2002， 13（7）： 58-101.

[2]Gui H， Tian W， Meng Q， et al. Improving axial resolution for holographic tracking of colloids and bacteria over a wide depth of field by optimizing different factors. Optics Express， 2018， 26（8）： 9920.

[3]Qi M， Song Q， Zhao J， et al. Three-dimensional bacterial behavior near dynamic surfaces formed by degradable polymer. Langmuir， 2017， 33（45）： 13098–13104.

[4]Zhou X， Qi M， Huang G， et al. Alternating electric fields induce a period-dependent motion of Escherichia coli in three-dimension near a conductive surface. Biointerphases， 2019， 14（1）： 011005.

[5]Snyder K， Quddus R， Hollingsworth A D， et al. Holographic immunoassays： direct detection of antibodies binding to colloidal spheres. Soft Matter， 2020， 16 （44）： 10180-10186.

[6]Kühn J， Charrière F， Colomb T， et al. Axial sub-nanometer accuracy in digital holographic microscopy. Measurement Science & Technology， 2008， 19（7）： 074007.

[7]Rappaz B， Barbul A， Emery Y， et al. Comparative study of human erythrocytes by digital holographic microscopy， confocal microscopy， and impedance volume analyzer. Cytometry A， 2010， 73A（10）： 895-903.

[8]Awatsuji Y， Sasada M， Kubota T. Parallel quasi-phase-shifting digital holography. Applied Physics Letters， 2004， 85（6）： 1069-1071.

[9]Zhang H， Jiang S， Liao J， et al. Near-field Fourier ptychography： super-resolution phase retrieval via speckle illumination. Optics Express， 2019， 27（5）： 1498-7512.

[10]Bishara W， Sikora U， Mudanyali O， et al. Holographic pixel superresolution in portable lensless on-chip microscopy using a fiberoptic array. Lab Chip， 2011， 11（7）： 1276-1279.

關(guān)鍵詞：數(shù)字全息 三維追蹤及成像 計算成像 ■