丹參酮ⅡA-甘草酸自組裝納米膠束的制備及體外抗腦膠質(zhì)瘤評價(jià)

梁啟凡,崔季維,張新茹,郭雨苗,王若寧,狄留慶

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210023)

丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TanⅡA)為中藥丹參中提取的脂溶性菲醌類化合物,是傳統(tǒng)中藥丹參的主要有效成分?！侗静菥V目》中即有記載丹參用于“活血,通心包絡(luò),治疝痛”[1],現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床心血管疾病治療和輔助治療[2]。最新研究表明,TanⅡA具有明顯的抗腫瘤活性,可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖與分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抵抗新生血管生成抑制實(shí)體瘤生長[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),TanⅡA能夠通過上調(diào)ADPRTL1和CYP1A1的表達(dá),誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長周期停滯于G0/G1期,同時(shí)上調(diào)Notch-1表達(dá)并抑制p-c-Myc、p-MMP-9以及p-Bcl-2表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的[4-5]。此外, 通過激活I(lǐng)L-15信號傳導(dǎo)，Tan ⅡA能夠顯著增加T-bet、GATA-3、Id2以及ETS-1的表達(dá)，激活JAK激酶并同時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活因子STAT5的磷酸化和活化，增加絲裂原活化蛋白激酶p38磷酸化以改善膠質(zhì)瘤免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞分化[6]。然而,TanⅡA溶解度低、口服生物利用度差等性質(zhì)限制了其臨床使用。通過磺酸化修飾對TanⅡA進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)改造能夠提高TanⅡA水溶性。但是,單一的治療模式難以應(yīng)對復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境;此外,多重生物屏障,例如血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)的存在嚴(yán)重阻礙了藥物在病變部位的累積,削弱了治療效果。因此,如何高效遞送TanⅡA至膠質(zhì)瘤部位已成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

中藥化學(xué)成分來源廣泛,結(jié)構(gòu)獨(dú)特,極易發(fā)生分子間相互作用而產(chǎn)生聚集或自組裝形成聚集體或自組裝顆粒[7]。如甾體、三萜類成分的剛性骨架、柔性的烷基側(cè)鏈和多手性中心的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其容易因疏水作用、氫鍵作用以及π-π堆積作用中的一種或多種共同影響而自組裝形成自組裝納米粒。甘草酸(Glycyrrhizic acid,GL)源于中藥甘草的根部皂苷,是一種兩親性分子,親水部分由葡萄糖醛酸殘基構(gòu)成,疏水部分是甘草酸殘基,能夠在水中聚集形成自組裝膠束,可以作為藥物載體用于改善藥物吸收[8]。GL不僅具有人工合成納米材料一樣的藥物包封能力,還具有優(yōu)于人工合成納米材料的生物可降解性、生物相容性和安全性。GL通過半胱天冬酶依賴性和獨(dú)立性途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,通過減少活性氧的產(chǎn)生和激活內(nèi)皮細(xì)胞中的ERK途徑來降低腫瘤細(xì)胞活性,通過抑制活性亞基p65進(jìn)而抑制NF-κB來抑制增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory cells,Tregs)和骨髓衍生抑制細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)可以通過Cox2/PGE2通路促進(jìn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成。GL可以通過抑制pSTAT3誘導(dǎo)Tregs和MDSC下調(diào),改善腫瘤免疫抑制的微環(huán)境,實(shí)現(xiàn)腫瘤的有效治療[10]。膠質(zhì)瘤微環(huán)境中同樣存在大量的Tregs和MDSCs,為GL與TanⅡA聯(lián)用以及多途徑協(xié)同治療膠質(zhì)瘤提供了理論基礎(chǔ)。

基于此,本研究利用了GL能夠自組裝形成膠束的特性,采用薄膜分散法將TanⅡA包封在膠束內(nèi)制備制劑TGM。本研究從載丹參酮ⅡA-甘草酸自組裝膠束的制備與表征、體外跨BBB能力評價(jià)及體外抗腦膠質(zhì)瘤活性評價(jià)等方面考察其特性。

1 材料

Nano-ZS90激光粒度分析儀,英國Malvern儀器有限公司;JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞破碎儀,寧波新芝生物科技有限公司;HT9800透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM),日本日立公司;Gallios流式細(xì)胞儀,美國貝克曼庫爾特公司;倒置熒光顯微鏡,Zeiss公司;酶標(biāo)儀,PerkinElmer公司。

丹參酮ⅡA,大連美侖生物技術(shù)有限公司;甘草酸,北京百靈威科技有限公司;香豆素6,碧云天有限公司;熒光染料DiI,蘇州宇恒生物科技有限公司;四水合氯化錳、四甲基偶氮唑鹽(MTT),美國Sigma公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒,南京建成有限公司;DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液、磷酸緩沖鹽溶液,美國Hyclone公司;胎牛血清,美國Gibco公司。

鼠源性腦膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞,南京貝佳生物公司;鼠源性腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3細(xì)胞,中科院上海細(xì)胞庫。

2 方法和結(jié)果

2.1 TGM的制備

分別采用乳化蒸發(fā)法、超聲分散法和薄膜分散法制備制劑。乳化蒸發(fā)法制備TGM:精密稱取一定量TanⅡA用氯仿配制成2 mg·mL-1溶液,分別取5、15、25 mg GL用4.5 mL超純水溶解。吸取500 μL TanⅡA的氯仿溶液于GL水溶液中,超聲處理15 min(200 W、2 s開/1 s關(guān)),使體系充分乳化呈白色乳液狀,轉(zhuǎn)移至100 mL茄型瓶中,30 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡氯仿,用0.8 μm濾膜過濾得到TGM。

超聲分散法制備TGM:精密稱取一定量TanⅡA用無水乙醇配制成1 mg·mL-1溶液,分別取5、15、25 mg GL用9 mL超純水溶解。取TanⅡA的乙醇溶液1 mL逐漸滴入GL的水溶液中,密封攪拌2.5 h,隨后在冰浴條件下進(jìn)行超聲處理,超聲處理15 min(200 W、2 s開/1 s關(guān)),用0.8 μm濾膜過濾得到TGM。

薄膜分散法制備TGM:精密稱取一定量TanⅡA用無水乙醇配制成1 mg·mL-1溶液,分別取5、15、25 mg GL,轉(zhuǎn)移至100 mL茄型瓶中,于45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醇,瓶壁上形成均勻薄膜,隨后加入5 mL超純水,輕微振蕩使藥物薄膜完全溶解于水中。隨后將溶液轉(zhuǎn)至20 mL西林瓶中,在冰浴條件下超聲破碎5 min(200 W、2 s開/1 s關(guān)),用0.8 μm濾膜過濾得到TGM溶液。

使用動態(tài)光散射激光粒度儀對多種制備方法下TGM的粒徑、PDI和Zeta電位進(jìn)行測定,如表1～3所示,通過乳化蒸發(fā)法和超聲分散法制備的3種投料比的TGM,粒徑和PDI過大,制劑參數(shù)變化范圍大,TGM無法通過EPR效應(yīng)聚集至膠質(zhì)瘤部位發(fā)揮相應(yīng)療效。如圖1所示,薄膜分散法制備的TGM相比之下粒徑和PDI穩(wěn)定且均較小,投料比為1∶15和1∶25的制劑溶液清澈無渾濁,出現(xiàn)明顯丁達(dá)爾效應(yīng)。則薄膜分散法確定為最終制備方法。

圖1 薄膜分散法制備不同比例TGM制劑拍攝圖

表1 乳化蒸發(fā)法制備TGM的粒徑、PDI和Zeta電位(±s,n=3)

表2 超聲分散法制備TGM的粒徑、PDI和Zeta電位(±s,n=3)

表3 薄膜分散法制備TGM的粒徑、PDI和Zeta電位(±s,n=3)

2.2 TGM的表征

2.2.1 TEM掃描 取適量的TGM以PBS緩沖液稀釋,滴加至超薄碳支持膜銅網(wǎng)上,靜置后濾紙吸去液體。滴加2%的磷鎢酸溶液進(jìn)行染色,濾紙吸去液體,進(jìn)行TEM掃描。

TGM呈現(xiàn)大小均一的圓球狀,粒徑為150 nm左右,與粒徑測量結(jié)果基本吻合(圖2)。

圖2 TGM的TEM圖

2.2.2 包封率測定 通過高效液相色譜法測定TGM中TanⅡA和GL的包封率(Entrapment efficiency,EE)。其中,TanⅡA的色譜方法:色譜柱為Thermo BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇∶水=90∶10,檢測波長為269 nm,流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL；GL的色譜方法:色譜柱為Thermo BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇∶0.1%磷酸水溶液=70∶30,檢測波長為250 nm,流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。取適量TGM于離心管中,加入10倍體積色譜級甲醇,水浴超聲10 min,12 000 r·min-1,離心10 min取上清,按照上述液相條件測定TanⅡA和GL含量計(jì)算EE。EE(%)=(藥物測得質(zhì)量/藥物實(shí)際投入質(zhì)量)×100%。

如表4所示,后續(xù)通過HPLC測定3種投料比制備TGM的藥物包封率,結(jié)果表明,當(dāng)投料比為1∶25時(shí),通過薄膜分散法制備TGM,粒徑和PDI分別為(121.87±5.85)nm、0.227±0.033,Zeta電位穩(wěn)定為(-22.3±1.2)mV,TanⅡA包封率最高為(88.54±14.27)%。因此,最終的制備工藝為上述薄膜分散法。

表4 HPLC測定TGM的TanⅡA包封率

2.2.3 藥物釋放 吸取2 mL TGM加入處理好的透析袋(截留分子量為8 000～14 000)中。釋放介質(zhì)分別為含2%吐溫-80的PBS緩沖液(0.1 mol·L-1,pH 7.4),漏槽條件。置于恒溫?fù)u床內(nèi)(37 ℃, 150 r·min-1)。分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)收集透析袋外的釋放介質(zhì),并立即補(bǔ)充等體積的新鮮相應(yīng)釋放介質(zhì)。釋放的藥物通過HPLC法進(jìn)行測定,計(jì)算累計(jì)藥物釋放率,并繪制藥物累計(jì)釋放曲線。

結(jié)果如圖3所示,經(jīng)自組裝膠束包載后的2種藥物在4～6 h左右才釋放其中大部分包載藥物,制劑的制備有效減緩藥物的釋放。

圖3 TGM藥物累計(jì)釋放考察

2.3 TGM跨BBB考察

將Transwell小室放入24孔板中,然后將bEnd.3細(xì)胞以每孔6×104的密度接種在Transwell小室中,上室300 μL細(xì)胞液,下室加入800 μL完全培養(yǎng)基,每2 d更換1次培養(yǎng)基。通過顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)并測量跨膜電阻來監(jiān)測bEnd.3單層的緊密度。當(dāng)bEnd.3單層的細(xì)胞與下腔室跨膜電阻高于200 Ω·cm2時(shí)即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在下室將GL261細(xì)胞以每孔5×104的密度接種。使用親脂性染料香豆素6(Coumarin6,C6)取代了TanⅡA,制備了C6-GL膠束C6-GL/M,用單培配置成含藥培養(yǎng)基,在上室加入300 μL含藥培養(yǎng)基,于12 h后利用倒置熒光顯微鏡拍攝上室和下室細(xì)胞。

TGM跨BBB效率結(jié)果見圖4。與bEnd.3細(xì)胞在上室共孵育后,通過倒置熒光顯微鏡觀察上室與下室的帶熒光標(biāo)記制劑的分布情況。結(jié)果如圖4所示,在下室可以觀察到C6-GL/M的分布,表明GL自組裝膠束具有很好的跨BBB能力。

圖4 倒置熒光顯微鏡觀察香豆素6標(biāo)記載體跨bEnd.3細(xì)胞后的分布情況

2.4 細(xì)胞攝取機(jī)制考察

將GL261細(xì)胞以每孔1.0×104的密度接種在96孔板上,待細(xì)胞貼壁后分別加入相應(yīng)抑制劑在以下條件孵育細(xì)胞:①5 mmol·L-1氯丙嗪以抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用;②10 mmol·L-1甲基β-環(huán)糊精以抑制小窩蛋白介導(dǎo)的胞吞作用;③5 mmol·L-1阿米洛利以抑制巨胞飲作用;④不加抑制劑的無血清培養(yǎng)基作為空白對照。用抑制劑預(yù)處理貼壁腫瘤細(xì)胞1 h,使用熒光染料DiI取代TanⅡA,制備DiI-GL/M,用單培配置成含藥培養(yǎng)基,加入含藥培養(yǎng)基,孵育1 h。棄去上層的培養(yǎng)基,加入100 μL DMSO溶解細(xì)胞以釋放DiI并用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(DiI:λEx/λEm=549/565 nm)。

結(jié)果如圖5所示,通過使用3種不同攝取機(jī)制的抑制劑,DiI-GL/M被GL261細(xì)胞攝取受到氯丙嗪抑制,相對攝取率減少至(80.26±0.03)%,表明TGM可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)入GL261細(xì)胞內(nèi),從而增強(qiáng)TanⅡA內(nèi)化到腫瘤細(xì)胞的能力。

注：與無抑制劑組比較，

2.5 MTT法考察TGM細(xì)胞毒性

取對數(shù)生長期的GL261細(xì)胞以完全培養(yǎng)基重懸(5×104mL-1),接種于96孔板中,每孔100 μL細(xì)胞液,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后,吸除培養(yǎng)基,空白對照孔加入無血清培養(yǎng)基100 μL,給藥孔分別加入含有不同濃度游離TanⅡA、游離GL及TGM。培養(yǎng)24 h,加入MTT(5 mg·mL-1,PBS溶解)10 μL,37 ℃,5%CO2孵育4 h。吸除每孔溶液,加入DMSO 150 μL,37 ℃恒溫?fù)u床中振蕩10 min,酶標(biāo)儀測定其在490 nm波長下的吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞存活率(%),并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

取對數(shù)生長期的bEnd.3細(xì)胞以完全培養(yǎng)基重懸(5×104mL-1),接種于96孔板中,每孔100 μL細(xì)胞液,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后,吸除培養(yǎng)基,空白對照孔加入無血清培養(yǎng)基100 μL,給藥孔分別加入含有不同濃度TanⅡA的TGM。培養(yǎng)24 h,加入MTT(5 mg·mL-1,PBS溶解)10 μL,37 ℃,5%CO2孵育4 h。吸除每孔溶液,加入DMSO 150 μL,37 ℃恒溫?fù)u床中振蕩10 min,酶標(biāo)儀測定其在490 nm波長下的吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞存活率(%)。細(xì)胞存活率(%)=(A給藥-A空白)/(A對照-A空白)。

結(jié)果如圖6所示,單獨(dú)給藥TanⅡA和GL時(shí),兩種藥物分別都對GL261細(xì)胞產(chǎn)生濃度依賴性細(xì)胞毒性作用,藥物的IC50值分別為2.95 μg·mL-1和5.15 μg·mL-1。但兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)顯著提高了抗腫瘤療效,當(dāng)TGM中TanⅡA的藥物濃度為4 μg·mL-1時(shí),細(xì)胞活力已降低至(34.09±6.58)%,兩藥聯(lián)合的IC50值為2.15 μg·mL-1，說明兩種藥物聯(lián)合使用具有更高效的抗腫瘤作用。

圖6 游離TanⅡA、游離GL和TGM對GL261細(xì)胞的細(xì)胞毒性考察

結(jié)果如圖7所示,TGM對小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯弱于小鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,兩藥聯(lián)合的IC50值為7.99 μg·mL-1。在制劑給藥的濃度下,正常細(xì)胞的存活率為(72.04±7.36)%,表明該制劑對正常腦細(xì)胞系的細(xì)胞毒性弱。

圖7 TGM對bEnd.3細(xì)胞的細(xì)胞毒性考察

2.6 Annexin V-FITC/PI法考察TGM促細(xì)胞凋亡能力

取對數(shù)生長期的GL261細(xì)胞以完全培養(yǎng)基重懸(2×105mL-1)，接種于12孔板中，每孔1 mL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，加入以無血清培養(yǎng)基配制稀釋的游離Tan ⅡA、游離GL及TGM的含藥培養(yǎng)基，不加藥物處理的細(xì)胞作為空白對照。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞沉淀，加入結(jié)合緩沖液0.5 mL重懸細(xì)胞，300目尼龍篩網(wǎng)過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊,加入5 μL Annexin V-FITC染液和10 μL PI染液輕輕混合均勻，室溫避光孵育10 min，置于流式管中，流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。

細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖8所示,分別將游離TanⅡA、游離GL和TGM作用于GL261細(xì)胞,3組藥物均表現(xiàn)出對GL261明顯的促凋亡作用。與Free TanⅡA、Free GL組相比,TGM的促細(xì)胞凋亡率分別由12.28%、13.32%上升至31.16%,其中晚期細(xì)胞凋亡比例明顯上升。表明TanⅡA與GL通過自組裝形成膠束后,更有利于被腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞所攝取,TanⅡA與GL協(xié)同作用能發(fā)揮出更強(qiáng)的抗腦膠質(zhì)瘤療效。

圖8 游離TanⅡA、游離GL和TGM對GL261細(xì)胞的促凋亡作用考察

3 討論

TanⅡA具有明顯的抗腦膠質(zhì)瘤效果,可以有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡、抑制新生血管形成及腫瘤轉(zhuǎn)移[11-14]。然而,TanⅡA水溶性差和口服生物利用度低限制了其臨床應(yīng)用[15]。利用納米技術(shù)將中藥活性成分負(fù)載于納米載體中,可以有效改善溶解度和生物利用度,增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性以及對病灶部位的靶向性。目前,研究人員嘗試了多種方法,如用薄膜水合法和探針超聲處理,將TanⅡA包載進(jìn)脂質(zhì)體內(nèi)部[16],將TanⅡA制備成納米乳液,改善TanⅡA在大鼠小腸中的吸收[17],將TanⅡA包載進(jìn)聚乙二醇制備的納米顆粒中,有效延長在人體內(nèi)的循環(huán)[18]。本研究采用GL自組裝膠束,通過薄膜分散法包載TanⅡA制備得到TGM最終制劑。TGM制劑溶液均一穩(wěn)定且澄清,可明顯觀察到丁達(dá)爾效應(yīng),TanⅡA包封率高,4～6 h穩(wěn)定釋藥;在GL自組裝納米膠束的包載下將TanⅡA運(yùn)輸通過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,被腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞所攝取從而發(fā)揮GL與TanⅡA的抗腫瘤療效,TGM相較于游離TanⅡA和游離GL對GL261細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。

中藥丹參活性成分TanⅡA因抗腫瘤、促進(jìn)血液循環(huán)、消除血瘀的功效,近年來已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌[19]、腎纖維化[20]等疾病的治療。但不易通過生物屏障、口服生物利用度低、水溶性差和滲透性低等特性使得TanⅡA難以用于腦膠質(zhì)瘤的治療[21]。本研究構(gòu)建的GL自組裝膠束,可有效裝載TanⅡA跨越BBB達(dá)到治療區(qū)域,兩藥的抗腦膠質(zhì)瘤療效協(xié)同作用,發(fā)揮有效的細(xì)胞毒性與促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,有效克服TanⅡA難以通過生物屏障、口服生物利用度低、水溶性差等缺點(diǎn),為TanⅡA一類水溶性差、半衰期短且生物利用度低的抗腫瘤中藥活性成分的遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)提供了參考。