利用HRM標(biāo)記檢測(cè)山東省稻瘟病菌群體的交配型分布

房文文，姜艷芳，王海鳳，郭濤，薛芳，張煥霞，張士永

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所/山東省水稻工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100）

由稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）引起的稻瘟病是水稻上的重要病害，危害性大、流行速度快，流行年份可造成嚴(yán)重減產(chǎn)［1］。山東省為黃淮海地區(qū)水稻主產(chǎn)區(qū)，以粳稻為主，年均種植面積達(dá)13萬(wàn)公頃。2014年臨沂、日照稻區(qū)發(fā)生稻瘟病，損失嚴(yán)重［2，3］。目前生產(chǎn)上防治稻瘟病經(jīng)濟(jì)有效的措施是種植抗病品種［4］，但由于田間稻瘟病菌小種類型多樣，易發(fā)生變異［5］，導(dǎo)致一些抗病水稻品種連續(xù)種植3～5年后抗性喪失，田間表現(xiàn)為感病［6，7］，造成減產(chǎn)。

高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）技術(shù)是一種新興的基因分型方法，能夠區(qū)分SNP、SSR及Indel等不同變異［8］。此技術(shù)無(wú)需凝膠電泳，減少了污染；PCR擴(kuò)增后僅需8～10 min便可以讀取96個(gè)樣品數(shù)據(jù)，真正實(shí)現(xiàn)了快速高通量檢測(cè)［9］。目前在稻瘟病菌無(wú)毒基因pex31（Avr-Pik/kp/km）檢測(cè)中已有應(yīng)用［10］。

有性生殖是真菌的一種生殖方式，分為同宗配合和異宗配合。同宗配合真菌通常具有一個(gè)交配型基因座，而異宗配合真菌有一對(duì)交配型基因座［11］。異宗配合真菌必須由不同交配型的菌絲細(xì)胞結(jié)合后才能產(chǎn)生子代。稻瘟病菌屬子囊菌廣大角間座殼屬的異宗配合真菌，具有MAT1-1和MAT1-2兩種交配型［12］，只有兩個(gè)不同交配型的菌株對(duì)峙培養(yǎng)才能誘導(dǎo)產(chǎn)生有性態(tài)［13］。目前在自然條件下還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌的有性生殖，在實(shí)驗(yàn)室研究有性生殖較多［14］。MAT交配型基因控制稻瘟病菌等真菌的“性別”，對(duì)真菌的遺傳進(jìn)化起著決定性作用。研究稻瘟病菌有性態(tài)，有利于解析稻瘟病菌群體遺傳多樣性，并為群體變異、交配識(shí)別等提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)可以獲得可育性菌株，為新的無(wú)毒基因的研究提供材料。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)稻瘟病菌有性生殖的研究工作已有大量報(bào)道。印度稻瘟病菌存在MAT1-1和MAT1-2兩種交配型［11］，美國(guó)稻瘟病菌僅存在MAT1-1交配型［15］，泰國(guó)稻瘟病菌僅存在MAT1-2交配型［16］。我國(guó)廣東省稻瘟病菌交配型MAT1-2占優(yōu)勢(shì)［17］，寧夏稻瘟病菌都是MAT1-1交配型［14］，黑龍江省稻瘟病菌存在MAT1-1和MAT1-2兩種交配型，以交配型MAT1-1占優(yōu)勢(shì)［18］。迄今未見關(guān)于山東省稻瘟病菌株有性態(tài)研究報(bào)道。因此本研究連續(xù)5年收集山東稻區(qū)的稻瘟病菌群體，基于高分辨率熔解曲線技術(shù)測(cè)定菌株群體的交配型，明確交配型在不同稻區(qū)的分布及年份間的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，以期為解析稻瘟病菌有性態(tài)及遺傳多樣性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

供試菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌株S1528和P131，交配型分別為MAT1-1和MAT1-2［19］，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授課題組贈(zèng)予。于2016—2020年從山東省濟(jì)南、濟(jì)寧、臨沂、日照、濱州及東營(yíng)6市水稻產(chǎn)區(qū)采集稻瘟病樣。

供試培養(yǎng)基：水瓊脂培養(yǎng)基（20 g瓊脂粉溶于1 L蒸餾水，分裝至三角瓶，121℃濕熱滅菌20 min）；番茄燕麥培養(yǎng)基（30～40 g燕麥片、20 g瓊脂粉、150 mL番茄汁、850 mL蒸餾水，分裝至三角瓶，121℃濕熱滅菌20 min）。

試劑及儀器：鹽酸四環(huán)素、氨芐青霉素鈉、硫磺卡那霉素、次氯酸鈉溶液、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR試劑，北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；EvaGreen qPCR核酸染料，美國(guó)Biotium公司。血球計(jì)數(shù)板（XB-K-25），上海XB-K-25求精生化試劑儀器有限公司；Optika B-383PLi顯微鏡，意大利M．A．D．公司；Nikon D90相機(jī)，尼康光學(xué)儀器（中國(guó)）有限公司；SPX智能型生化培養(yǎng)箱、RXZ-500C-LED人工氣候培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；BCD-290W 型立式冰箱，青島海爾股份有限公司；羅氏LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Roche公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 稻瘟病樣本采集及病菌分離、培養(yǎng) 在山東省濟(jì)南、濟(jì)寧、臨沂、日照、濱州、東營(yíng)6市代表性地區(qū)和多年稻瘟病重發(fā)區(qū)采集典型稻瘟病樣本。挑選單個(gè)典型病斑剪成約5 mm大小于次氯酸鈉消毒2．5 min，無(wú)菌水沖洗干凈后平鋪至水瓊脂平板上。顯微鏡下將分生孢子稀釋至1個(gè)視野下2～3個(gè)孢子，轉(zhuǎn)移至新的水瓊脂平板上。待分生孢子萌發(fā)后，鏡檢挑取單個(gè)孢子放至番茄燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3 d得到單孢菌落。將單孢菌株純化后，選菌落邊緣菌絲點(diǎn)接至鋪滿濾紙片的番茄燕麥培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7 d后將濾紙片揭下放入硫酸紙袋內(nèi)，干燥完全后-20℃保存。將待活化菌株的濾紙片點(diǎn)接到番茄燕麥培養(yǎng)基上，28℃光照培養(yǎng)，5～7 d后取菌絲［20］。

1．2．2 稻瘟病菌交配型分析 采用CTAB法提取稻瘟病菌基因組DNA。參照稻瘟病菌交配型基因序列［19］設(shè)計(jì)兩對(duì)引物［生工生物工程（上海）股份有限公司合成，表1］進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（10μL）：2×EasyTaq?PCR SuperMix 5μL、DNA 3 μL、正反向引物各0．2μL（0．1 mmol/L）、20×Evagreen 0．125μL、ddH2O 1．475μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。熔解曲線分析程序?yàn)椋?5℃變性15 s；60℃退火15 s；以0．07℃/s的速率升溫，10次/℃采集熒光信號(hào)，至90℃保持1 s。采用軟件Light Cycler 96進(jìn)行熔解曲線分析。

表1 稻瘟病菌交配型基因的引物序列

為了解山東省稻瘟病菌群體交配型，對(duì)不同地區(qū)間及不同年份間稻瘟病菌交配型多樣性分布進(jìn)行分析［18］。H＝N/（N-1）×（1-ΣXi2），式中，H為多樣性指數(shù)，N為群體總菌株數(shù)，Xi為某交配型在其群體中的出現(xiàn)頻率。采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2．1 山東省稻瘟病菌的交配型

本試驗(yàn)共分離到稻瘟病菌株415株（表2）。利用兩對(duì)特異性引物檢測(cè)稻瘟病菌交配型，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株得到的熔解曲線，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈突變位點(diǎn)的退火溫度（Tm值）不同區(qū)分不同的基因型，結(jié)果（圖1）表明，當(dāng)熔解溫度為78～80℃時(shí)，稻瘟病菌為MAT1-1交配型；當(dāng)熔解溫度為82～84℃時(shí)，稻瘟病菌為MAT1-2交配型。熔解曲線檢測(cè)結(jié)果顯示，山東省稻瘟病菌交配型分布不均衡：415株稻瘟病菌株中交配型為MAT1-1的菌株有12株，出現(xiàn)頻率為2．89%；交配型為MAT1-2的菌株有329株，出現(xiàn)頻率為79．28%；雙交配型的菌株有4株，出現(xiàn)頻率為0．96%；未檢測(cè)出交配型的菌株有70株，出現(xiàn)頻率為16．87%。

表2 本研究分離稻瘟病菌情況

橙色曲線代表MAT1-1交配型，綠色曲線代表MAT1-2交配型。

2．2 不同年份間稻瘟病菌的交配型

由表3可知，2016年供試菌株總計(jì)45株，交配型為MAT1-2的菌株有33株，出現(xiàn)頻率為73．33%；未檢測(cè)出交配型的菌株有10株，出現(xiàn)頻率為22．22%；交配型為MAT1-1的菌株有2株，出現(xiàn)頻率為4．44%；不存在雙交配型的菌株。2017年供試菌株總計(jì)63株，交配型為MAT1-2的菌株有52株，出現(xiàn)頻率為82．54%；交配型為MAT1-1的菌株有6株，出現(xiàn)頻率為9．52%；未檢測(cè)出交配型的菌株有5株，出現(xiàn)頻率為7．94%；不存在雙交配型的菌株。2018年供試菌株總計(jì)108株，交配型為MAT1-2的菌株有71株，出現(xiàn)頻率為65．74%；未檢測(cè)出交配型的菌株有32株，出現(xiàn)頻率為29．63%；交配型為MAT1-1的菌株有4株，出現(xiàn)頻率為3．70%；雙交配型的菌株有1株，出現(xiàn)頻率為0．93%。2019年供試菌株總計(jì)91株，交配型為MAT1-2的菌株有66株，出現(xiàn)頻率為72．53%；未檢測(cè)出交配型的菌株有22株，出現(xiàn)頻率為24．18%；不存在MAT1-1的菌株；雙交配型的菌株有3株，出現(xiàn)頻率為3．30%。2020年供試菌株總計(jì)108株，交配型為MAT1-2的菌株有107株，出現(xiàn)頻率為99．07%；未檢測(cè)出交配型的菌株有1株，出現(xiàn)頻率為0．93%；不存在交配型為MAT1-1和雙交配型菌株。

2016年山東省稻瘟病菌群體交配型多樣性指數(shù)為0．471，2017年為0．315，2018年為0．572，2019年為0．478，2020年為0．019。表明2018年稻瘟病菌群體多態(tài)性最高，2020年稻瘟病菌群體多態(tài)性最低。

表3 2016—2020年山東省稻瘟病菌株交配型測(cè)定結(jié)果 （株，%）

2．3 各地區(qū)稻瘟病菌的交配型

對(duì)供試菌株的交配型按照地區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果（表4）表明，魯北地區(qū)稻瘟病菌群體中MAT1-2、未檢測(cè)出交配型、雙交配型菌株的出現(xiàn)頻率分別為87．40%、11．81%、0．79%，不存在MAT1-1交配型菌株；魯中地區(qū)稻瘟病菌群體中MAT1-2、未檢測(cè)出交配型、MAT1-1、雙交配型菌株的出現(xiàn)頻率分別為79．67%、17．07%、2．44%、0．81%；魯南地區(qū)稻瘟病菌群體中MAT1-2、未檢測(cè)出交配型、MAT1-1、雙交配型菌株的出現(xiàn)頻率分別為72．73%、20．61%、5．45%、1．21%。

對(duì)供試菌株群體交配型進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)山東省供試稻瘟病菌群體交配型多樣性指數(shù)為0．371。魯北、魯中及魯南地區(qū)稻瘟病菌群體交配型多樣性指數(shù)分別為0．238、0．368、0．471，表明魯南地區(qū)稻瘟病菌群體的多態(tài)性比北部和中部地區(qū)高。

表4 山東省不同地區(qū)稻瘟病菌交配型測(cè)定結(jié)果 （株，%）

3 討論與結(jié)論

目前常規(guī)檢測(cè)交配型的方法主要是PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，該方法效率較低，難以實(shí)現(xiàn)批量化檢測(cè)。本試驗(yàn)采用高分辨率熔解曲線（HRM）技術(shù)測(cè)定稻瘟病菌群體交配型，可快速、準(zhǔn)確區(qū)分交配型基因分型，顯著縮短檢測(cè)所需時(shí)間，能夠?qū)崿F(xiàn)大批量稻瘟病菌交配型的快速檢測(cè)。本試驗(yàn)方法可用于異宗配合的子囊真菌交配型的檢測(cè)，有利于在絲狀真菌交配型檢測(cè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用，對(duì)研究真菌遺傳變異具有重大意義。

本研究發(fā)現(xiàn)山東省水稻種植區(qū)的稻瘟病菌群體中存在MAT1-1和MAT1-2兩種交配型，且以交配型MAT1-2占優(yōu)勢(shì)，出現(xiàn)頻率為79．28%，交配型MAT1-1出現(xiàn)頻率僅為2．89%。已有研究結(jié)果［14-18］也表明，不同地區(qū)的稻瘟病菌交配型分布存在差異。在自然條件下山東省稻瘟病菌很難發(fā)生有性生殖，是否存在有性生殖還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

盡管基于PCR-HRM方法測(cè)定了山東稻瘟病菌群體的交配型，但是不能檢測(cè)菌株的育性，后續(xù)將通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)檢測(cè)育性，并與PCR方法檢測(cè)交配型結(jié)果進(jìn)行結(jié)合，從而使結(jié)論更加準(zhǔn)確。

致謝：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授、趙文生教授、楊俊教授贈(zèng)予標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)131和S1528，特此致謝！