磁性納米顆粒在環(huán)境中類固醇激素檢測的應(yīng)用與研究進展

劉宇塵，周劍*，王敏*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室（北京 100081）；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室（北京 100081）

類固醇激素（steroid hormones，SHs）是一類脂溶性，低分子量的具有內(nèi)分泌干擾作用的四環(huán)脂肪烴化合物[1]。其分為人工及化學(xué)合成兩大類，常應(yīng)用于畜牧業(yè)和集中養(yǎng)殖過程中作為避孕藥、動物生長調(diào)節(jié)劑及農(nóng)業(yè)肥料，主要通過動物排泄過程進入環(huán)境[2]。進入環(huán)境后類固醇激素的降解困難，其對水、土壤、沉積物和其他環(huán)境介質(zhì)的污染逐漸成為新的健康問題。同時也可能隨著食物鏈流入人體內(nèi)，人體過量攝入SHs會產(chǎn)生多種內(nèi)分泌危害，如改變荷爾蒙水平，擾亂生物體的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，增加人類罹患心血管疾病，前列腺癌和乳腺癌等風(fēng)險，并且可能誘發(fā)男性生殖系統(tǒng)疾病，胎兒畸形和女性化等危害[2-3]。內(nèi)分泌疾病的發(fā)病期十分廣泛，從出生至死亡，且在不同時期甚至同一時期會出現(xiàn)患有多種內(nèi)分泌疾病的情況。類固醇激素微小的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異造就截然不同的功能特性，在環(huán)境中含量較低屬于痕量存在，且不同類固醇激素之間的合成轉(zhuǎn)化途徑復(fù)雜，使得準(zhǔn)確檢測既十分必要也十分困難[4]。因此選擇合適，靈敏準(zhǔn)確的檢測方法成為檢測的重中之重。傳統(tǒng)前處理技術(shù)有固相萃?。⊿PE），液液萃?。↙LE），固相微萃取（SPME）等，廣泛應(yīng)用于類固醇激素的富集和提取，但存在耗時長、操作繁瑣、吸附劑用量高的弊端。因此，開發(fā)簡便、高效的前處理方法成為近些年研究熱點[3,5]。

磁性納米材料的興起為萃取吸附劑的選擇提供更為廣闊的思路。根據(jù)其獨特的超順磁性特點，可在外部磁場作用下輕易吸附并解析目標(biāo)化合物，極大簡化了提取過程，縮短了樣品基質(zhì)分離時長[6-8]。用于提取類固醇激素的磁性吸附劑包括磁性碳納米管、鐵包埋的多孔碳材料（MIL-53-C）、核-殼磁性共價有機骨架、磁性印跡納米顆粒、磁性納米聚吡咯、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）包覆的Fe3O4@辛酸NP、核-殼聚多巴胺涂覆的磁性納米顆粒等[9]。磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）因其穩(wěn)定性高、比表面積大而廣泛應(yīng)用于藥業(yè)、化妝品、工業(yè)及食品行業(yè)的檢測。傳統(tǒng)的MNPs有Fe3O4、ZnFe2O4、Ni/NiO@GrC、MnFe2O4和NiMn2O4。Fe3O4由于其成本相對較低和簡單的合成過程及對人體健康和環(huán)境的低毒性而成為最受歡迎的一種MNPs[10]。

對近年來利用不同類型磁性納米復(fù)合材料制備的新型磁性吸附劑在食品添加劑檢測中的應(yīng)用研究進行綜述，回顧磁性吸附劑的研究進展。同時，討論磁性固相萃取在食品添加劑檢測分析中的最新進展，為其在食品安全分析中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 類固醇激素及其檢測技術(shù)

1.1 類固醇激素

類固醇激素根據(jù)作用不同可分為雌激素、雄激素、孕激素和糖皮質(zhì)激素4大類。這類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)共享一個相同的環(huán)戊烷多氫菲核[2-3]。它們由內(nèi)分泌腺產(chǎn)生，隨血液運送至全身。在膽固醇衍化及各種酶的作用下經(jīng)復(fù)雜的轉(zhuǎn)化鏈形成不同的SHs[1]。其復(fù)雜的合成代謝途徑使得準(zhǔn)確檢測面臨很大困難。大多數(shù)SHs會隨著人體及動物排泄過程進入環(huán)境，研究表明，環(huán)境中的SHs多數(shù)存在于廢水及土壤中，且不易降解。很有可能隨著食物鏈重新進入人體[11]。進入人體后會改變荷爾蒙水平，擾亂生物體的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，增加人類罹患心血管疾病，前列腺癌和乳腺癌等風(fēng)險[7,9-10]。同時在動物飼料中非法使用激素藥物導(dǎo)致肉品中激素殘留的事件也時有發(fā)生，據(jù)報道[12]我國在監(jiān)測和抽查中多次在動物源性食品中檢出違禁激素類藥物殘留，出口食品屢發(fā)貿(mào)易壁壘事件，曾一度影響動物源性食品出口量，是激素監(jiān)控的重點[13]。因此開發(fā)良好準(zhǔn)確的分析方法十分重要，同時為保障消費者健康及我國進出口貿(mào)易往來，必須建立靈敏度高、特異性好、可靠的動物源性食品中類固醇激素檢測方法，提高監(jiān)管有效性。

圖1 典型類固醇激素結(jié)構(gòu)圖

圖2 磁性固相萃取過程

1.2 檢測方法

1.2.1 前處理技術(shù)

傳統(tǒng)的前處理技術(shù)包括固相萃取（SPE）、液液萃?。↙LE）、固相微萃?。⊿PME）、磁性固相萃?。∕SPE）和QuEChERS等[3,5,10-11,13]。固相萃?。⊿PE）是樣品制備中使用最廣泛的方法。然而，SPE存在回收率低、操作繁瑣等局限性。當(dāng)油性成分過多或目標(biāo)物顆粒較大時就會堵塞色譜柱，導(dǎo)致回收率絳低[14]。QuEChERS以其快速、簡便、便宜、有效、堅固和安全的特點引起更多關(guān)注。通過添加顆粒吸附劑（PSA、C18、無水MgSO4和中性Al2O3等），也存在用ZnO代替無水MgSO4和NaCl進行目標(biāo)物的提取。該方法在一定程度上彌補SPE耗時長的缺點，且已成功用于檢測各種復(fù)雜基質(zhì)中的化合物，如獸藥、農(nóng)藥、激素和霉菌毒素[15]。磁性固相萃?。∕SPE）作為一種新型前處理技術(shù)，因其耗時短、操作簡單和高選擇性而備受關(guān)注。

1.2.2 檢測技術(shù)

痕量分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、超高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等[15-16]。氣相色譜區(qū)別于液相色譜的主要特點是其在上機檢測前需要進行繁雜的衍生化步驟。二者均具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法分析的抗干擾能力強，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的檢出限較低[17-18]。

2 磁性納米材料在類固醇激素檢測中的應(yīng)用

2.1 磁性納米材料

磁性納米材料作為吸附劑，可以很好地分散在水溶液中，并借助外部磁場進行分離。功能化的磁性納米材料應(yīng)用前景十分廣泛[19]，表面的磁性涂層通常會對磁性產(chǎn)生重大影響，2種不同磁性相的結(jié)合將產(chǎn)生新的磁性納米復(fù)合材料，進一步擴大應(yīng)用范圍。磁球表面接枝的有機官能團通過化學(xué)作用力（疏水相互作用、范德華力、氫鍵和π-π共軛等）可特異性吸附化合物[20-21]。裸露的納米粒子活性很高，易在空氣中發(fā)生氧化，損失其磁性及分散性[22]。因此可以在磁性粒子表面通過包覆方式添加保護膜保持其活性如接枝或涂覆有機物，包括表面活性劑或聚合物，或涂覆有無機層如二氧化硅或碳[23]。合適的表面涂層可以一定程度上減少團聚及沉淀現(xiàn)象，提高納米顆粒在檢測中的循環(huán)使用次數(shù)[24]。應(yīng)用于類固醇激素提取的磁性材料涂覆層有聚苯胺（PANI）、聚多巴胺（PDA）、MIL-101（Cr）、聚四氫呋喃（PTHF）、羰基納米顆粒（石墨烯、氧化石墨烯、碳納米管和C60等）、金屬有機骨架和環(huán)糊精（CD）[25]。聚苯胺（PANI）因其簡單的合成步驟，高的熱穩(wěn)定性，良好的提取性能和低成本，被廣泛應(yīng)用。PANI具有豐富的苯環(huán)和氨基結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生π-π相互作用，氫鍵和疏水作用因此可用于提取結(jié)構(gòu)含有苯和羥基的類固醇激素[26-27]。PDA涂覆層具有羥基、氨基等官能團。既可與磁性材料結(jié)合又可通過疏水作用、π-π堆積和氫鍵等作用力進一步接枝其他活性功能成分[29]，其最常用于包覆Fe3O4形成核殼型的Fe3O4@PDA MNPs。CD是一種由D-吡喃葡萄糖單元聚合而成的環(huán)狀低聚糖，它獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)-疏水性空腔和親水性外表面使其成為一種良好的吸附劑[30]。

常見的納米顆粒合成方法包括共沉淀、熱分解、熱還原、微乳法、水熱合成和激光熱解技術(shù)[31]。共沉淀是合成Fe3O4的一種簡便方法，指在反應(yīng)試劑中通過化合物沉淀的方式形成新的混合物[32-34]。通過控制Fe2+/Fe3+比例，并用沉淀劑調(diào)節(jié)混合液的pH進行合成。反應(yīng)在N2保護下進行，劇烈攪拌一段時間后會生成黑色沉淀物，采用磁鐵吸附分離，反復(fù)用水和有機溶劑洗滌，真空干燥后即可得到Fe3O4粒子。該方法因操作簡便成為應(yīng)用最廣的制作方法，但也存在明顯弊端，即合成的磁性顆粒易聚團，從而減少反應(yīng)的比表面積與活性位點，降低吸附性能。

水熱法指用水溶液作為反應(yīng)體系，通過在高壓釜中升溫?zé)峒訅?，?chuàng)造出一個相對密閉的高溫高壓環(huán)境，使得物質(zhì)重新結(jié)晶的一種方法[35]。該方法制得的粉體粒度小，團聚現(xiàn)象較輕，且顆粒分布均勻[36]。主要特點即溫度與壓力，其溫度在130～250 ℃之間。水熱法一般只能制備氧化物粉體，而反應(yīng)過程中的晶核形成與生長過程的影響因素并沒有太多深入研究的有效結(jié)論[37]。

微乳法是將磁性納米顆粒形成，聚集和團聚的過程控制在一個微小的球形液滴內(nèi)，從而避免成型后的磁性顆粒進一步聚團。消除吸附過程中團聚現(xiàn)象引發(fā)的回收率低的問題。該方法合成的顆粒粒度較窄，更易控制[38]。

溶膠-凝膠法[39]是指由一種前驅(qū)體混合物經(jīng)水解，縮合等化學(xué)反應(yīng)后形成穩(wěn)定的透明體系。再經(jīng)固化熱處理后形成固體化合物的方法。常見的前驅(qū)體物質(zhì)包括酯類化合物或金屬醇鹽等。根據(jù)形成機制不同可分為3種類型[40]：傳統(tǒng)凝膠型、無機聚合物型和絡(luò)合物型。其操作成本昂貴，且原料物具有一定毒性，凝膠時間較長。

磁性納米粒子的大小，形狀和組成在很大程度上取決于所用鹽的類型（例如，氯化物，硫酸鹽，硝酸鹽），F(xiàn)e2+/Fe3+比率，反應(yīng)溫度，pH和介質(zhì)的離子強度。通常為10～20 nm[41]。

2.2 磁性復(fù)合材料在類固醇激素檢測中的應(yīng)用與研究

An等[42]首次提出基于Fe3O4磁性納米顆粒（MNPs）的新型磁性固相萃取技術(shù)。用溶劑熱合成法合成Fe3O4顆粒，通過多巴胺的氧化自聚反應(yīng)包覆在Fe3O4表面形成聚多巴胺涂層，MNPs表面的PDA將含有Au的金屬鹽還原得到Fe3O4@PDA@AU，經(jīng)試驗得到的這種高效的磁性吸附劑Fe3O4@PDA@Au可有效提取出尿液、牛奶和水樣中的類固醇激素，目標(biāo)物的線性范圍為0.8～500 μg/L，并且都具有良好相關(guān)性（R2≥0.991），檢出限為0.20～0.25 μg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%～4.63%。經(jīng)評估該吸附劑可循環(huán)使用4次。Lekota等[43]合成Fe3O4-Al2O3@CNFs納米復(fù)合材料，并在此基礎(chǔ)上建立一種超聲波輔助分散磁性固相萃取的前處理方法，結(jié)合高效液相色譜和二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）定量檢測廢水中的17-βE2。該方法線性范圍較廣為0.1～1 000 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 1，檢出限為0.025 μg/L。Li等[44]用沉淀法制備出石墨烯作為磁性固相萃取材料，建立了用于分析測定水樣中的雙酚A的MSPE-HPLC方法。結(jié)果顯示Fe3O4@G對雙酚A具有良好的富集作用。在5.0～1 000.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。檢出限為0.1 μg/L，回收率在88.19%～99.56%之間（SRSD＜3.00%）。

2.3 磁性金屬有機骨架材料在類固醇激素檢測中的應(yīng)用與研究

金屬-有機骨架（MOF）是一類從內(nèi)置納米多孔雜化材料的自組裝之間的金屬離子（或簇）和有機配位體[45]。較為成熟的MOF材料有HKUST、UiO、ZIF、MIL。ZIF是一類沸石咪唑酯骨架材料，是利用咪唑與Zn（Ⅱ）或Co（Ⅱ）的配位反應(yīng)合成的沸石類結(jié)構(gòu)MOF材料[46-47]。MIL材料是使用不同的過渡金屬元素和琥珀酸，戊二酸等二羧酸配體合成。目前已成功應(yīng)用于提取SHs的有MIL-53（Al）、MIL-100（Fe）和MIL-101（Cr）[47]。在眾多MIL材料中，MIL-101（Cr）的超高孔隙率，多個不飽和鉻位及出色的溶劑穩(wěn)定性使其獲得廣泛的應(yīng)用與關(guān)注，被成功應(yīng)用于樣品預(yù)處理過程中[48]。Wang等[49]將MIL-101（Cr）接枝在Fe3O4表面形成新型吸附劑Fe3O4@ MIL-101（Cr），并基于此材料建立一種MSPE-HPLC-MS/MS用于檢測廢水中的非甾體激素，且吸附劑用量僅30 mg。該方法回收率為81.2%～116.8%，線性范圍在0.1～50 μg/L。Huang等[50]將Triton X-114作為親水涂層通過疏水相互作用與MIL-101（Cr）表面相結(jié)合，提高其在水溶液中的分散性，增強吸附劑的吸附性能。用N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺作氣相色譜前衍生化，建立一種GC-MS方法測定環(huán)境水樣中的內(nèi)分泌干擾物。

圖3 典型吸附材料及吸附過程中可能存在的化學(xué)作用力

碳納米管因其徑向尺寸小，故而具有較大的比表面積，可分為單壁碳納米管和多壁碳納米管[51-52]。多面體低聚倍半硅氧烷（POSS）是納米尺寸的籠狀有機-無機雜化分子。POSS因其具有獨特的籠狀結(jié)構(gòu)及納米尺寸，可以增強生成的聚合物的熱穩(wěn)定性[53]。無機硅氧烷籠可提供熱穩(wěn)定性和機械強度，而有機取代基可提供與聚合物的相容性和反應(yīng)性。該課題組合成Fe3O4@PAA與Fe3O4@PAA@POSS這2種納米顆粒，并結(jié)合HPLC與HPLC-MS/MS，成功應(yīng)用于肉制品及環(huán)境水中類固醇激素的檢測。

2.4 磁性分子印跡材料在類固醇激素檢測中的應(yīng)用與研究

分子印跡技術(shù)即通過聚合洗脫等過程形成一個與被測物空間構(gòu)型相匹配的特定空穴達到對模板分子及其類似物特異性吸附的作用。以無毒低成本的Fe3O4作為磁性主成分的研究較多[54]。具有專一性吸附作用的磁性納米材料獲得廣泛關(guān)注。Czarny等[55]采用球形硅膠的分子印跡聚合物，建立一種分子印跡固相萃取高效液相色譜技術(shù)選擇性地富集吸附水樣中的類固醇激素。該方法具有高回收率（78.7%～101.3%）、低檢出限（0.018 2～0.089 8 mg/L）的優(yōu)點。Du等[8]通過可逆的加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)，制備出地塞米松的分子印跡聚合物。將其作為磁性吸附劑結(jié)合高效液相色譜技術(shù)用于快速，選擇性地提取檢測化妝品中地塞米松的含量。化妝品加標(biāo)測試的回收率為93.8%～97.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD小于2.7%，檢出限和定量限分別為0.05 μg/mL和0.20 μg/mL。

表1 磁性納米材料在樣品前處理過程中的應(yīng)用

3 結(jié)語

磁性固相萃取的應(yīng)用極大地縮短傳統(tǒng)前處理方法存在的耗時長、吸附劑用量大、操作繁瑣等弊端。磁性吸附劑的尺寸在納米級別，一般為10～20 nm，因此微量合成好的磁性納米材料即可滿足檢測需求，顯著降低天平稱量過程中不可避免引入的誤差。磁性材料的改性合成是MSPE的核心，根據(jù)不同目標(biāo)物選擇不同的接枝官能團。通常吸附劑與目標(biāo)物間的分子間作用力為共價鍵、疏水相互作用、氫鍵和π-π共軛等。溶液pH、磁性吸附劑用量及提取時長都是影響吸附效率的重要因素。今后研究方向應(yīng)進一步增強MSPE的特意選擇性，探索相關(guān)的化學(xué)作用力。類固醇激素結(jié)構(gòu)相似，因此吸附劑與其相關(guān)作用力也基本相同，準(zhǔn)確快速提取某種類固醇激素仍面臨重大考驗。