雞肉中硝基呋喃類獸藥殘留量檢測能力驗證

呼念念 ，陳冬東，黎燁昕，呼秀智，彭濤*，江利華*

1.河北工程大學生命科學與食品工程學院（邯鄲 056038）；2.中國檢驗檢疫科學研究院（北京 100176）

硝基呋喃類獸藥是一類合成廣譜抗菌劑，該類藥物能夠抑制大多數革蘭陽性菌和革蘭陰性菌、真菌及原生動物某些原蟲的活性，因而被廣泛應用于預防和治療疾病[1-2]。研究表明，若長期或者大劑量對動物使用硝基呋喃類獸藥會產生毒性和副作用，能夠致癌、致畸和誘導基因突變[3-5]。我國2002年也頒發(fā)了禁止使用硝基呋喃抗生素的禁令[6-7]。因此為了對硝基呋喃類獸藥的監(jiān)測、為保障食品的安全性，開展硝基呋喃類獸藥殘留量檢測能力驗證計劃，考察實驗室檢測硝基呋喃類獸藥殘留量的能力十分必要。

能力驗證（proficiency testing，PT）是利用實驗室間比對確定實驗室檢測能力的活動，也可有效補充實驗室內部質量控制[8-10]。為客觀反映實驗室檢測雞肉中獸藥殘留的技術能力和水平，促進該類測試項目檢測能力的提高，組織、實施雞肉中硝基呋喃類獸藥殘留定量分析能力驗證計劃。通過能力驗證計劃對參加單位實驗室結果進行技術分析，以期為相關管理部門進行綜合評價實驗室資源提供相應參考，促進相關實驗室提高其技術水平和質量管理能力[11-12]。

1 能力驗證實施與研究

1.1 能力驗證樣品制備

能力驗證計劃所用樣品為白羽肉雞，根據預先設計的不同給藥量對所購白羽肉雞進行飼喂給藥試驗，連續(xù)給藥7 d。間隔適當時間后進行宰殺，獲取含有硝基呋喃類代謝物殘留的雞肉組織的陽性樣品。采取雞胸肉作為能力驗證樣品原料，將其剔除筋膜、肥肉等組織，在攪拌機中進行充分攪拌，攪拌成肉糜，將充分混勻的肉糜進行凍干，凍干后的樣品進行粉碎、過篩并進行2次混勻。共制備兩批不同濃度樣品，樣品采用鋁箔袋進行分裝，規(guī)格為每袋10 g，在-15 ℃以下冷凍保存。

1.2 檢測方法

能力驗證計劃要求實驗室按照日常檢測程序進行檢測，不限定檢測方法。實驗室在進行結果提交時需要提交硝基呋喃類代謝物結合態(tài)和游離態(tài)的總量。推薦選用GB/T 21311—2007《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯質譜法》[13]進行測定。

1.3 樣品均勻性和穩(wěn)定性考察

按照CNAS-GL003《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[14]的規(guī)定，從分裝好的樣品中，每組各隨機抽取10個樣品（n=10），每個樣品至少平行測定2次，并采用單因素方差分析方法對其進行均勻性考察。

短期穩(wěn)定性通過模擬樣品運輸條件，并采用t檢驗法評定考察樣品的短期穩(wěn)定性。長期穩(wěn)定性測定間隔按先密后疏的原則設計，分別在第7，第15，第30和第60天各隨機抽取3份樣品進行測定，采用t檢驗法進行考察。

1.4 樣品發(fā)放

能力驗證計劃共設計發(fā)放2份不同濃度的樣品。按照隨機數表，給每個實驗室隨機分配不同濃度的樣品各1份。樣品編號為Axxx、Bxxx，其中字母A、B用于區(qū)分2個樣品，每個樣品的標識均具有唯一性，以進一步提高樣品的保密性和可溯源性。樣品發(fā)放前在-15 ℃以下冷凍保存。

1.5 結果統(tǒng)計方法與評價

能力驗證計劃按照ISO 13528：2015《利用實驗室間比對進行能力驗證的統(tǒng)計方法》[15]的要求，采用穩(wěn)健統(tǒng)計技術的統(tǒng)計方式處理檢測結果和評價結果。對參加者的檢測結果，按式（1）計算z值。

式中：x為參加者檢測結果；X為指定值；σ為能力評定標準差。實驗室結果的判定原則：|z|≤2.0為滿意結果；2.0＜|z|＜3.0為可疑結果；|z|≥3.0為不滿意結果。

2 結果與分析

2.1 樣品的均勻性和穩(wěn)定性考察

2.1.1 均勻性檢測

按照CNAS-GL003[14]的要求，采用單因素方差分析法對樣品進行均勻性檢驗，對檢測結果采用單因素方差分析法進行統(tǒng)計分析，方差分析結果如表1所示，結果表明在0.05顯著水平時，能力驗證樣品中的呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物含量均勻。

表1 A樣品中呋喃唑酮代謝物均勻性測定方差分析結果

2.1.2 穩(wěn)定性檢測

短期穩(wěn)定性模擬樣品實際運輸條件，分別郵寄樣品到溫度偏高或溫差大的異地后，進行郵寄返給組織者測試的方式。在2021年5月將分裝好的樣品分別郵寄海南、哈爾濱、烏魯木齊、杭州四地，考察能力驗證樣品短期穩(wěn)定性。采用t檢驗法評定樣品的穩(wěn)定性，短期穩(wěn)定性的t值均小于95%置信區(qū)間查表值，其結果未見顯著差異，未觀測到不穩(wěn)定，說明能力驗證樣品滿足實際運輸要求。

依據CNAS-GL003[14]要求，采用t檢驗法對樣品的穩(wěn)定性進行考察。結果表明，計算的t值均小于95%置信區(qū)間臨界值，各測定時間測定結果無顯著性差異，樣品穩(wěn)定性良好，達到能力驗證樣品要求。長期穩(wěn)定性結果見表2和表3。

表2 呋喃唑酮代謝物長期穩(wěn)定性檢驗結果

表3 呋喃它酮代謝物長期穩(wěn)定性檢驗結果

2.2 實驗室參加情況

報名能力驗證實驗室共42家，其中41家參加呋喃唑酮代謝物項目測試，39家參加呋喃它酮代謝物項目測試。42家實驗室分布于全國17個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），其中參加本次能力驗證計劃的實驗室較多的?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）為山東省，共9家，其具體分布情況見圖1。

圖1 參加實驗室分布情況

2.3 能力驗證統(tǒng)計結果

2.3.1 測定結果的總體分布

圖3 呋喃唑酮代謝物B樣品含量測定結果數據分布圖

圖4 呋喃它酮代謝物A樣品含量測定結果數據分布圖

能力驗證共收回實驗室檢測結果160個，對測定結果數據的頻數進行統(tǒng)計，根據頻數繪制分布直方圖并進行正態(tài)擬合，見圖2～圖5數據分布圖。能力驗證回收的檢驗結果近似服從正態(tài)分布，采用穩(wěn)健統(tǒng)計技術算法A對數據進行分析。

圖2 呋喃唑酮代謝物A樣品含量測定結果數據分布圖

圖5 呋喃它酮代謝物B樣品含量測定結果數據分布圖

2.3.2 測定結果統(tǒng)計量

能力驗證共回收42家實驗室的檢測結果，將42家實驗室反饋的測定結果采取算法A進行結果統(tǒng)計，能力驗證項目檢測結果統(tǒng)計量見表4。由表4可知，能力驗證實驗室內穩(wěn)健C.V.值近28%，表明各實驗室檢測結果離散性較大，檢測水平有較大差異。

表4 檢測結果統(tǒng)計量匯總表

2.4 試驗結果分析

2.4.1 離群值分析

經統(tǒng)計，實驗室編碼為9的實驗室反饋的檢測結果與樣品本身含量相差較大，查閱該實驗室上傳的原始記錄發(fā)現其標準溶液儲備液濃度應為1 000 ng/mL，但是檢測人員在配制標準工作溶液的過程中將儲備液濃度記錄的為100 ng/mL，致使標準曲線濃度較低，導致樣品濃度超出標準曲線濃度，最終測得結果比樣品原本含量較低，與樣品原本含量相差10倍多。因此該實驗室的結果被判定為離群值。

2.4.2 不同檢測方法結果滿意情況分析

能力驗證計劃推薦的方法為GB/T 21311—2007。但實驗室可根據自身實際情況，采用日常使用的方法進行檢測。實驗室檢測所用方法的統(tǒng)計結果見表5。由表5可以看出，能力驗證項目結果滿意率與檢測方法的選擇無較大影響。

表5 不同檢測方法統(tǒng)計

2.4.3 非滿意結果分析

在對能力驗證項目非滿意結果進行分析時，發(fā)現非滿意實驗室提交的呋喃唑酮代謝物或呋喃它酮代謝物各項目的兩份樣品結果存在較為一致的負偏差。通過查閱相關實驗室提供的原始記錄等材料對結果偏離的實驗室進行技術分析。

1) 硝基呋喃類代謝物殘留量的測定大多將水解后的樣品進行衍生化處理，在37 ℃恒溫箱中過夜16 h反應。在能力驗證項目中實驗室編碼為31的實驗室原始記錄顯示其進行37 ℃水浴鍋中恒溫1 h反應。該實驗室能力驗證項目結果均為不滿意。因此需考慮衍生反應的時間、溫度，樣品是否完全衍生，以免對檢測結果的準確性造成影響。

2) 對于硝基呋喃類代謝物的提取大多數方法都使用乙酸乙酯提取，在提取時要盡可能充分提取，容易出現提取不充分引起結果偏低的現象；在樣品前處理過程進行殘渣復溶時，需考慮溶劑的種類和體積后是否能充分溶解，這兩方面會對試驗結果的準確性有一定影響。能力驗證項目中大部分實驗室使用1 mL 0.1%甲酸水溶液對殘渣進行復溶。實驗室編碼為6的實驗室使用GB/T 21311—2007的檢測方法，其使用2 mmol/L醋酸銨溶液對殘渣進行復溶，其能力驗證結果為可疑。因此其可疑結果可能會與復溶溶劑的選擇有關，對最終檢測結果造成一定影響。

3) 能力驗證項目中實驗室編碼為5的實驗室計算所得樣品濃度在標準曲線濃度范圍之外，低于標準曲線最低點濃度。實驗室編碼為6和21的實驗室計算所得樣品濃度較為靠近標準曲線最低點，可能帶入較大誤差，導致計算結果偏離，從而影響最終結果。由此可以看出，在設置標準曲線范圍時要合理，線性范圍應包含被檢測樣品的濃度。

4) 查閱原始記錄可知實驗室編碼為23和33的實驗室使用內標方法定量時，選取內標溶液濃度過高，其內標響應值與樣品目標物響應值相差10倍，從而會影響最終結果的準確性，有可能會導致實驗室檢測結果為可疑或不滿意結果。因此實驗室在檢測過程中應保證內標溶液和樣品溶液響應值的大小。

由于部分參加實驗室的原始記錄未對樣品的前處理過程進行記錄描述，原始記錄過于簡單，缺少標準品純度、配制過程、計算過程或圖譜數據等信息，無法進一步分析判斷。對于結果出現一致性較大偏倚的實驗室，建議應從方法、儀器、試劑、人員操作等可能存在的系統(tǒng)誤差對結果進行分析，及時找出可能存在的問題。

2.5 連續(xù)能力驗證計劃結果分析

2016—2021 年間，實驗室連續(xù)開展5年雞肉中硝基呋喃類獸藥的檢測能力驗證項目。本次能力驗證項目中有連續(xù)參加的實驗室。2016—2021年連續(xù)參加實驗室的Z值分布圖，見圖6。由圖6可知實驗室編碼為2，14，32，35和42為近5年連續(xù)參加的實驗室。由圖7分析可知，實驗室編碼為2和42的兩家實驗室，通過連續(xù)參加此項能力驗證項目，其Z值結果由可疑值逐步上升為滿意結果，且檢測結果與指定值越來越接近。實驗室編碼為14的實驗室，根據其2016—2021年實驗室Z值分布圖可看出該實驗室檢測結果雖然其Z值都為滿意結果，但都為正偏差結果，說明該實驗室部分檢測系統(tǒng)存在一定系統(tǒng)偏差。因此，建議實驗室內部進行系統(tǒng)偏差分析糾正。實驗室編碼為32和35的2家實驗室從Z值分布圖可看出其五年Z值均為滿意結果，且與指定值越為接近。由此可見，通過連續(xù)參加雞肉中硝基呋喃類藥物的測定能力驗證活動，實驗室的檢測結果滿意率逐年上升，檢測水平逐年提高。檢測實驗室通過連續(xù)參加能力驗證活動，可以有效提高檢驗數據的可靠性和有效性，發(fā)現與其他實驗室之間的差距及問題所在，有利于實驗室的檢測能力進一步提高。

圖6 連續(xù)參加實驗室Z值分布圖

3 結論

對全國42家實驗室開展雞肉中硝基呋喃類獸藥殘留量測定的能力驗證工作，結果滿意率較高，說明參加能力驗證的實驗室具備較好的檢測該項目的能力。在能力驗證中，通過查閱原始記錄等材料發(fā)現部分實驗室因標準品配制過程記錄出現錯誤、對能力驗證要求查看不細致，標準曲線線性范圍設置不合理等問題，從而造成實驗室提交結果為非滿意結果。分析近5年連續(xù)參加雞肉中硝基呋喃類藥物的測定的實驗室，通過連續(xù)參加此項能力驗證活動，實驗室的檢測結果滿意率呈上升趨勢，檢測水平逐步提升。因此建議實驗室不僅要提升檢測技術水平，也需要加強實驗室質量體系的建設，并通過持續(xù)參加能力驗證活動，不斷發(fā)現檢驗中存在的問題，從而提升檢驗能力。