冰核蛋白對凍結(jié)與消融速度影響研究

陸丹旭， 龔建英， 何延青， 郭嘉宇， 李潤玲

（1.河北建筑工程學(xué)院市政與環(huán)境工程系，河北張家口 075000；2.河北省水質(zhì)工程與水資源綜合利用重點實驗室，河北張家口 075000）

20世紀70年代，Schnell等［1］發(fā)現(xiàn)腐爛樹葉中含有一種重要的冰核物質(zhì)，開啟了細菌成冰核作用的研究.隨后，Maki等［2］從腐爛的赤楊樹葉中提取分離得到了一種名為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的細菌，發(fā)現(xiàn)將這種細菌添加到0 ℃時依然為液體狀態(tài)的過冷卻水中就能催化誘導(dǎo)它形成冰晶，并把這種特性稱作細菌的冰核活性. Lindow等［3］發(fā)現(xiàn)草生歐文氏菌（Erwinea herbicola）也是一種冰核細菌. 在這之后，許多國家的學(xué)者對冰核細菌深入研究，發(fā)現(xiàn)了具有同種特性的3個屬19個種或變種為冰核細菌［4］. 冰核細菌能夠在細胞外膜產(chǎn)生一類特殊蛋白質(zhì)——冰核活性蛋白（ice nucleation protein，INP）［5-8］，INP 是細菌表面展示系統(tǒng)中經(jīng)典的載體蛋白，是存在于熒光假單胞菌、假單胞桿菌、黃單胞菌屬和歐氏桿菌等細菌種屬中的一種分泌性型表面蛋白［9］. INP擁有可在-5～-2 ℃這樣相對高的溫度下形成質(zhì)地細膩、外形規(guī)則的微小異質(zhì)冰晶的能力［10］. 具有冰核蛋白冰核活性的細菌在冰核蛋白的作用下能使水分子按照一定的順序規(guī)則排列形成質(zhì)地細膩的冰晶核. 目前對于冰核蛋白的研究與應(yīng)用主要集中在促凍殺蟲、植物保護、作物抗寒育種、食品工業(yè)以及人工降雪等領(lǐng)域［11-16］，但是目前冰核蛋白在人工造雪中應(yīng)用效果的研究報道并不多.

隨著全球氣候變暖導(dǎo)致的氣候極端性和不穩(wěn)定性上升，導(dǎo)致北半球積雪面積呈下降趨勢［17］，全球許多冬季旅游勝地都因為降雪量少或環(huán)境溫度過高而出現(xiàn)了少冰缺雪的現(xiàn)象. 人為添加冰核蛋白作為晶核的人工造雪技術(shù)，可以在0 ℃左右成雪，且雪粒間不會相互粘連，物理抗擊性能好，成雪密度和含水量更易滿足滑雪場的造雪需要［18］. 而且可以提高水的利用率，有效節(jié)約水資源并保護水環(huán)境［19］. 因此，冰核蛋白在制造冰雪技術(shù)方面具有重大的推廣價值［20］. 但是，目前商用生物冰核劑造價高，不利于國內(nèi)需求量大的滑雪場大規(guī)模使用. 篩選優(yōu)化出適于在我國冰雪產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用的新的冰核蛋白劑，對于我國在冰雪產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域擁有節(jié)水型人工冰雪制劑和相關(guān)產(chǎn)品的自主研發(fā)權(quán)，爭取逐步脫離進口做到自給自足，從而推動我國在冰雪產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展具有重要的意義.

1 實驗方法與實驗過程

1.1 菌種來源與保存

本研究所用的冰核蛋白原液由中科院微生物研究所提供.

菌種優(yōu)化過程：以Pantoea ananatis基因組DNA 為模板，以XhoI 和BglⅡ為引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增冰核蛋白（INP）基因，并插入到pYB1S的XhoI和BglⅡ位點，產(chǎn)生pYB1S-INP. 將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BW25113 中，得到用于INP 表達的重組菌株BW/pYB1a-INP. 大腸桿菌BW/pYB1a-INP 菌株用LB 培養(yǎng)基，氨芐西林（50 μg）250 r/min，37 ℃培養(yǎng). 將過夜培養(yǎng)物接種到含有1%接種物的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM 培養(yǎng)基中，并在30 ℃振蕩培養(yǎng)16 h. 通過在8000×g 下離心10 min 來收集誘導(dǎo)后的細胞，用去離子水洗滌四次，然后懸浮在去離子水中以形成細胞懸浮液（OD600=10 OD/mL）并通過超聲裂解. 之后原液分裝并-20 ℃冷凍保存，本實驗中所使用的冰核蛋白原液的初始質(zhì)量濃度為0.23 mg/mL.

1.2 不同濃度冰核蛋白溶液的制備

每次實驗前先將原液樣品冰上解凍后和水混合進行稀釋，解凍后的冰核蛋白原液用自來水混合稀釋分別稀釋10 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、2000 倍和5000 倍，即分別得到質(zhì)量濃度為2.3×10-2、2.3×10-3、4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL 的冰核蛋白溶液. 在實驗中，相同體積的自來水樣本作為空白對照組.

預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)直接使用自來水水溫較高，降溫至各組實驗溫度所需時間較長，所以本實驗全部采用提前準備好的4 ℃自來水制備溶液，這也更加接近冬季用水的實際情況.

1.3 實驗過程

實驗中使用的冰核蛋白混合溶液體積有100 mL和1000 mL兩種.

凍結(jié)實驗在焓差室中進行，具體步驟為：①調(diào)整焓差室溫度，實驗溫度分別為-5 ℃、-10 ℃和-15 ℃，控制環(huán)境溫度誤差為±0.5 ℃. ②在室溫下迅速稀釋好的不同濃度的混合溶液后快速放置到焓差室中后，記錄時間和環(huán)境溫濕度，每隔5 min人工觀察燒杯中溶液凍結(jié)的變化，全程利用攝像機做好過程記錄. ③待所有燒杯中的溶液表面均凍結(jié)后，實驗結(jié)束. 每次凍結(jié)實驗的觀察時間為120 min，如果120 min內(nèi)未能夠凍結(jié)，記錄為“未凍結(jié)”.

消融實驗在實驗室常溫條件下進行，觀察消融的過程并隨時記錄觀察到的現(xiàn)象和變化.

2 實驗結(jié)果分析

2.1 -5 ℃不同濃度冰核蛋白溶液凍結(jié)速度的比較

-5 ℃的環(huán)境溫度下在焓差室內(nèi)進行了2次實驗，第一次實驗溶液的體積為100 mL，第二次實驗溶液的體積為1000 mL. 具體結(jié)果參見表1.

表1 -5 ℃不同濃度冰核蛋白溶液的凍結(jié)時間Tab.1 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-5 ℃

第一次實驗中發(fā)現(xiàn)添加冰核蛋白確實加快了溶液凍結(jié)的速度；而且從總的趨勢來看，添加冰核蛋白溶液濃度越高，溶液凍結(jié)的速度越快. 但是添加冰核蛋白的質(zhì)量濃度大于4.6×10-4mg/mL時，提高核微生物溶液濃度，溶液凍結(jié)的速度變化很小，而且添加的冰核蛋白溶液濃度過高會造成溶液的透明度低，從而導(dǎo)致最后成冰的透明度不夠好；同時最終成冰會伴隨較多的氣泡，且不如濃度低的溶液產(chǎn)生的冰堅實. 所以，從增加濃度與提高凍結(jié)速度的成本、效益以及成冰質(zhì)量綜合考慮，后續(xù)實驗只用質(zhì)量濃度為4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL的溶液進行實驗.

第二次實驗每組實驗所使用各濃度溶液的體積由100 mL 增加為1000 mL，實驗現(xiàn)象與結(jié)果與前兩組實驗基本一致，結(jié)冰是從溶液表面開始的，先有冰碴、逐漸形成冰層后才繼續(xù)向下延展；與空白溶液的凍結(jié)速度相比較，添加冰核蛋白可以加快凍結(jié)速度（圖1）. 由此可見，冰核蛋白用于大規(guī)模造雪、成冰是具有發(fā)展前景和應(yīng)用優(yōu)勢的.

圖1 不同濃度冰核蛋白溶液凍結(jié)實驗Fig.1 Freezing experiments of ice nucleoprotein solutions with different concentrations

2.2 -10 ℃不同濃度冰核蛋白溶液凍結(jié)速度的比較

-10 ℃的環(huán)境溫度下在焓差室內(nèi)同樣進行了兩次實驗，第一次實驗所使用不同濃度溶液的體積為100 mL，第二次實驗每組實驗所使用不同濃度溶液的體積為1000 mL. 具體結(jié)果參見表2.

表2 -10 ℃不同濃度冰核蛋白溶液的凍結(jié)時間Tab.2 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-10 ℃

通過實驗發(fā)現(xiàn)：添加冰核蛋白快了溶液凍結(jié)的速度；低濃度溶液結(jié)冰后透明度更高，高濃度溶液結(jié)冰后會有較多氣泡. 在溶液凍結(jié)速度接近的情況下，4.6×10-4mg/mL 的溶液中生成的冰與其他質(zhì)量濃度的溶液相比，雖然溶液凍結(jié)的速度較快，但是透明度與硬度相對會差一些. 相對于其他質(zhì)量濃度溶液來講，4.6×10-5mg/mL 的溶液和空白組生成的冰層硬度更高也更透明，但是4.6×10-5mg/mL的溶液比4.6×10-4mg/mL的溶液結(jié)冰速度慢. 兼顧冰的質(zhì)量與結(jié)冰所需時間，1.15×10-4mg/mL的溶液凍結(jié)速度更為適宜，此濃度可能是效果最佳的. 但是-10 ℃環(huán)境溫度實驗的效果沒有-5 ℃環(huán)境下的實驗明顯. 而在相同實驗條件下，不同實驗溶液體積實驗對比發(fā)現(xiàn)，體積1000 mL 的溶液凍結(jié)實驗中所用凍結(jié)時間小于100 mL溶液凍結(jié)實驗，這是由于隨著實驗溶液體積增大，實驗所用器皿變大，因此，實驗溶液與環(huán)境接觸面積增大，散熱面積增加的緣故.

2.3 -15 ℃不同濃度冰核蛋白溶液凍結(jié)速度的比較

-15 ℃的環(huán)境溫度下在焓差室內(nèi)進行了一次實驗，實驗所使用的溶液體積均為1000 mL. 實驗具體結(jié)果參見表3.

表3 -15 ℃不同濃度冰核蛋白溶液的凍結(jié)時間Tab.3 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-15 ℃

通過-5 ℃、-10 ℃和-15 ℃三個不同環(huán)境溫度下溶液凍結(jié)速度與成冰效果的實驗對比分析，可以看出，溫度越低冰核蛋白對成冰速度的影響越小，而在-5 ℃時，添加冰核蛋白對成冰速度的提高影響較為顯著. 因此，在-5 ℃這樣相對高的溫度下添加冰核蛋白確實有利于增加溶液凍結(jié)的速度.

2.4 消融實驗

為了能夠更直觀地觀察不同濃度冰核蛋白對冰消融的速度的影響，取體積為1000 mL，凍結(jié)溫度-5、-10 ℃，冰核蛋白溶液質(zhì)量濃度為4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL 以及空白對照組樣品放入冰箱內(nèi)完全結(jié)冰，取出后在18 ℃的室溫環(huán)境下進行消融實驗，具體結(jié)果見表4.

表4 不同稀釋濃度溶液的消融開始發(fā)生消融時間Tab.4 Onset time of ablation for solutions with different dilution concentrations

-5 ℃下凍結(jié)樣品消融實驗中：14 min 時空白樣品杯壁處消融，樣品中心已經(jīng)有氣泡，冰能夠活動；19 min時4.6×10-5、1.15×10-4、2.3×10-4mg/mL 的樣品燒杯底部有消融，其中，4.6×10-5mg/mL 的樣品最明顯；27 min時4.6×10-5mg/mL 的樣品已經(jīng)能在燒杯中活動；32 min時1.15×10-4mg/mL 的樣品也能活動，2.3×10-4mg/mL 的樣品變得更透明、杯壁處消融但不能活動.

-10 ℃下凍結(jié)樣品消融實驗中：19 min時空白樣品的燒杯底部有消融；27 min時4.6×10-5mg/mL的樣品開始消融滴水；32 min時2.3×10-4、1.15×10-4mg/mL的樣品變得透明度變高、杯壁處開始消融；50 min時4.6×10-4mg/mL樣品中不斷有水滴滴下來，但是速度緩慢；62 min時所有樣品都開始加速消融，其中空白樣品的消融速度最快.

通過消融實驗（圖2）發(fā)現(xiàn)：添加冰核蛋白后能夠有效減緩消融的速度，使冰保持的時間更長，且冰核蛋白溶液質(zhì)量濃度最高的4.6×10-4mg/mL 樣品消融速度最慢.

圖2 不同濃度冰核蛋白溶液消融實驗Fig.2 Ablation experiments of ice nucleoprotein solutions with different concentrations

3 結(jié)論

通過添加不同濃度冰核蛋白之后溶液凍結(jié)以及消融速度的實驗對比得出如下結(jié)論：

1）本研究的冰核蛋白由于其成冰核活性能夠影響冰的凍結(jié)過程和消融過程，相比不添加冰核蛋白的空白對照組，添加冰核蛋白的實驗組能夠加快溶液凍結(jié)的速度，也能延長溶液凍結(jié)的時間.

2）在一定添加濃度的范圍內(nèi)，添加的冰核蛋白濃度越低，成冰的透明度越高.

3）添加不同濃度冰核蛋白的效果在環(huán)境溫度較高的情況下較為明顯，當(dāng)環(huán)境溫度過低時，添加冰核蛋白作用對溶液凍結(jié)速度的影響不明顯.

綜上，利用本種冰核蛋白作為晶核能夠影響溶液成冰的速度和質(zhì)量，也能夠有效減緩冰消融的速度并提高冰保存的時長. 從冰的凍結(jié)速度、透明度和堅實程度綜合考慮，添加質(zhì)量濃度為1.15×10-4mg/mL（即稀釋2000倍）的冰核蛋白作為冰晶核可以有效提升水—冰相變的效率，如應(yīng)用于人工造雪技術(shù)，在冬季早晚典型的邊際天氣條件下可以更加有效提高人工造雪的效率.