長鏈非編碼RNA LINC00346調(diào)控微小RNA-138-5p對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

忽平，王麗媛

宮頸癌是全球第四大常見的女性癌癥［1］，盡管診斷和治療手段不斷進(jìn)步，但宮頸癌每年導(dǎo)致超過25萬人死亡［2］。其轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致宮頸癌病人預(yù)后較差，反復(fù)治療導(dǎo)致耐藥性，因此發(fā)現(xiàn)宮頸癌新的治療靶點，可有效提高病人生存率和生存質(zhì)量。

研究表明，多種長鏈非編碼RNA（long non-cod‐ing RNA，lncRNA）、微小RNA（micro RNA，miRNA/miR）在宮頸癌中表達(dá)異常，并通過lncRNA-miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控癌癥的進(jìn)展［3-4］。LINC00346在原發(fā)性肝癌組織和細(xì)胞株、胃癌和非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞的生存、增殖、凋亡等過程，且與miR-138-5p存在結(jié)合位點［5-7］。miR-138-5p在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)宮頸癌的惡性進(jìn)展［8］。然而LINC00346和miR-138-5p在宮頸癌中的關(guān)系尚未可知。本研究檢測宮頸癌組織中LINC00346的含量，并以宮頸癌（cer‐vical cancer）海拉細(xì)胞為研究對象，探討LINC00346和miR-138-5p對海拉細(xì)胞增殖、凋亡影響的分子機(jī)制，旨在為宮頸癌分子靶向治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1材料選取2018年1—12月于南陽市中心醫(yī)院手術(shù)治療的28例宮頸癌病人的宮頸癌組織及癌旁正常組織（距離宮頸癌組織邊緣>5 cm）為研究對象，年齡（50.32±13.12）歲，范圍為23～72歲，宮頸鱗癌23例，宮頸腺癌5例。所有病人術(shù)前未接受放療和化療。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，并且病人均簽署知情同意書。

人宮頸癌細(xì)胞株海拉細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫提供；胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基由美國Hy‐clone公司生產(chǎn)，噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）及胰蛋白酶由美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)；Tran‐swell板由美國Corning公司生產(chǎn)；引物、LINC00346干擾物（si-LINC00346）、miR-138-5p mimics（miR-138-5p）、miR-138-5p抑制物（anti-miR-138-5p）、陰性對照（si-NC、miR-NC和anti-miR-NC）由上海吉瑪制藥有限公司生產(chǎn)；凋亡檢測試劑盒由上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑由美國Invitrogen公司生產(chǎn)；雙熒光素酶報告系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay System）由美國Pro‐mega公司生產(chǎn)；Total RNA提取、Real-time PCR及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；Re‐al-time PCR儀由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將宮頸癌細(xì)胞株海拉細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素及RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中，并于37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的海拉細(xì)胞應(yīng)用上述細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至1×l06個/毫升，接種于6孔板中（濃度為2×103個/孔），并于細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，嚴(yán)格遵循轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將si-NC、si-LINC00346、miR-NC、miR-138-5p、si-LINC00346+anti-miR-NC、si-LINC00346+anti-miR-138-5p的載體分別轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)好的海拉細(xì)胞孔板中。于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）驗證，確保無誤后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測LINC00346和miR-138-5p mRNA的表達(dá) 收集“1.2.2”中轉(zhuǎn)染驗證后的海拉細(xì)胞，依據(jù)RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求提取總RNA，并快速將其逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。嚴(yán)格按照qRT-PCR的說明書合成LINC00346和miR-138-5p。LINC00346正向引物5′-CACCATGTTGGC‐CAGGCTGGT-3′，LINC00346反 向引物：5′-GGC‐CAAAGAGTGACCATCATC-3′；miR-138-5p正向引物：5’-GGAGCTGGTGTTGTGAATCA-3’，反向引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。用2?ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測海拉細(xì)胞中周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）和胱天蛋白酶-3（caspase-3）的蛋白含量 收集轉(zhuǎn)染驗證后的各組海拉細(xì)胞，RI‐PA蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，取適量蛋白溶液，100℃煮沸10 min。蛋白變性后，以每孔30μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），用轉(zhuǎn)膜儀濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封膜2 h。分別加入P21和caspase-3一抗（P21：兔來源單克隆抗體，1∶1 000；caspase-3：兔來源單克隆抗體，1∶500），4℃孵育過夜。洗膜后，加入山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶200），室溫孵育1 h。洗膜后，避光滴加ELC顯影液顯影，凝膠成像拍照。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.2.5MTT法測定細(xì)胞存活率 收集轉(zhuǎn)染驗證后的各組海拉細(xì)胞，于胰蛋白酶消化后，接種于96孔板中（2×103個/孔），培養(yǎng)48 h后每孔分別加入MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清培養(yǎng)液，并于每孔加入DMSO溶解結(jié)晶150μL，室溫條件下振蕩5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度。存活率（%）=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對數(shù)生長期的各組海拉細(xì)胞，PBS清洗2遍，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為1×105個/毫升。應(yīng)用上流式細(xì)胞儀并嚴(yán)格按照凋亡檢測試劑盒說明書完成細(xì)胞凋亡率檢測。

1.2.7雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證LINC00346與miR-138-5p的靶向關(guān)系 根據(jù)“1.2.2”方法完成海拉細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的LINC00346的野生型（WT-LINC00346）和突變型（MUT-LINC00346）雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-138-5p對海拉細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，離心并收集上清，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，檢測并計算螢火蟲熒光素酶的相對活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LINC00346在宮頸癌組織中的表達(dá)qRTPCR結(jié)果表明，與正常癌旁組織相比，宮頸癌組織中LINC00346 mRNA含量顯著升高［（2.51±0.08）比（0.99±0.05），t=85.26，P<0.001］。

2.2敲除LINC00346對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖和凋亡的影響轉(zhuǎn)染si-LINC00346后，與si-NC組相比，si-LINC00346組宮頸癌海拉細(xì)胞中的LINC00346含量顯著下降，P21和caspase-3蛋白含量升高，細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1和表1。說明敲除LINC00346可以抑制海拉細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

表1 敲除LINC00346對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、凋亡的影響/±s

表1 敲除LINC00346對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、凋亡的影響/±s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。

組別si-NC si-LINC00346 t值P值重復(fù)次數(shù)9 9 LINC00346 1.00±0.05 0.33±0.03 34.47<0.001存活率/%100.00±6.13 52.84±4.39 18.76<0.001凋亡率/%8.19±1.00 23.39±1.64 23.74<0.001 P21 0.22±0.02 0.63±0.04 27.50<0.001 caspase-3 0.30±0.03 0.79±0.05 25.21<0.001

圖1 敲除LINC00346對宮頸癌海拉細(xì)胞P21、caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.3LINC00346靶向調(diào)控miR-138-5pTargetscan預(yù)測結(jié)果顯示，LINC00346的序列中含有與mi R-138-5p互補(bǔ)的位點，見圖2。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與miR-NC對照組相比，miR-138-5p組野生型WT-LINC00346的海拉細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降［（0.24±0.03）比（0.97±0.05）］（t=37.56，P<0.001）；而突變型MUT-LINC00346的海拉細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化［（0.98±0.05）比（0.99±0.05）］（t=0.42，P=0.677）。說明LINC00346靶向結(jié)合miR-138-5p。qRT-PCR結(jié)果顯示，敲除LINC00346可顯著上調(diào)miR-138-5p含量［（2.43±0.07）比（1.01±0.05）］（t=49.52，P<0.001）。說明LINC00346靶向負(fù)調(diào)控miR-138-5p表達(dá)。

圖2 LINC00346靶向miR-138-5p

2.4轉(zhuǎn)染miR-138-5p對海拉細(xì)胞增殖、凋亡的影響轉(zhuǎn)染miR-138-5p后，與miR-NC組相比，miR-138-5p組海拉細(xì)胞中miR-138-5p含量升高，細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，P21和caspase-3蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見圖3和表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-138-5p對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、凋亡的影響/±s

表2 轉(zhuǎn)染miR-138-5p對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、凋亡的影響/±s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。

組別miR-NC miR-138-5p t值P值重復(fù)次數(shù)9 9 miR-138-5p 1.00±0.04 2.88±0.06 78.21<0.001存活率/%100.03±6.04 63.88±4.92 13.92<0.001凋亡率/%8.15±0.98 19.64±1.35 20.66<0.001 P21 0.21±0.02 0.54±0.04 22.14<0.001 caspase-3 0.29±0.03 0.67±0.04 22.80<0.001

圖3 miR-138-5p對宮頸癌海拉細(xì)胞凋亡及P21、caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.5下調(diào)miR-138-5p能逆轉(zhuǎn)敲除LINC00346對海拉細(xì)胞增殖和凋亡的影響為明確LINC00346通過調(diào)控miR-138-5p影響海拉細(xì)胞的增殖、凋亡，我們同時敲除LINC00346和下調(diào)miR-138-5p，結(jié)果顯示，與si-LINC00346+anti-miR-NC組相比，si-LINC00346+antimiR-138-5p組miR-138-5p含量降低，細(xì)胞存活率升高，凋亡細(xì)胞數(shù)升高，P21和caspase-3蛋白含量降低，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.001），見表3。說明下調(diào)miR-138-5p可逆轉(zhuǎn)敲除LINC00346對海拉細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

表3 下調(diào)miR-138-5p和敲除LINC00346對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、凋亡的影響/±s

表3 下調(diào)miR-138-5p和敲除LINC00346對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、凋亡的影響/±s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。

組別si-LINC00346+anti-miR-NC si-LINC00346+anti-miR-138-5p t值P值重復(fù)次數(shù)9 9 miR-138-5p 1.02±0.05 0.30±0.03 37.04<0.001存活率/%52.79±4.35 88.29±5.32 15.50<0.001凋亡率/%23.41±1.65 11.91±1.37 16.09<0.001 P21 0.62±0.04 0.28±0.03 20.40<0.001 caspase-3 0.77±0.05 0.38±0.04 18.27<0.001

3 討論

宮頸癌中異常表達(dá)的lncRNAs通過抑制或促進(jìn)腫瘤發(fā)展，在宮頸癌的預(yù)后、腫瘤進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡和抗放射治療中發(fā)揮調(diào)控作用［9-10］。

lncRNA LINC00346在多種癌癥中表達(dá)異常，與癌癥的進(jìn)展和耐藥性有關(guān)。LINC00346在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，LINC00346基因敲除可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡［11］。LINC00346在 胰 腺 癌 中 也 高 表 達(dá)，敲 除LINC00346抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；在體外和體內(nèi)，LINC00346的缺失也增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性［12］。LINC00346在乳腺癌癌中過表達(dá)，與總體低生存率相關(guān)，可能是預(yù)后標(biāo)志物［13］。但尚未有研究闡述LINC00346是否影響宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常癌旁組織相比，LINC00346在宮頸癌組織中含量也顯著升高，敲除LINC00346可以抑制海拉細(xì)胞存活率，提高細(xì)胞凋亡率及P21和caspase-3蛋白含量。說明LINC00346參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

本研究通過TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p與LINC00346序列中存在可結(jié)合位點，兩者可能存在結(jié)合關(guān)系。miR-138-5p在膠質(zhì)瘤［14］、胰腺癌［15］、肺腺癌［16］、結(jié)直腸癌［17］和膀胱癌［18］等多種癌癥中表達(dá)下調(diào)，調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的血管生成，過表達(dá)miR-138-5p通過靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）抑制胰腺癌的自噬和腫瘤生長，抑制肺腺癌的細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、增殖和轉(zhuǎn)移，也可靶向人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（hTERT）抑制結(jié)直腸癌。miR-138-5p在宮頸癌中也表達(dá)下調(diào)，miR-138-5p的表達(dá)降低與宮頸癌病人的FIGO分期晚期、分化不良、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總體生存率低下有關(guān)，miR-138-5p的過度表達(dá)可以通過靶向SIRT1抑制細(xì)胞增殖，阻滯G0/G1期細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［19］。本研究通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，LINC00346靶向結(jié)合miR-138-5p，且下調(diào)LINC00346可上調(diào)miR-138-5p表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，過表達(dá)miR-138-5p可抑制細(xì)胞存活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)miR-138-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)敲減LINC00346對海拉細(xì)胞增殖和凋亡的作用，間接說明LINC00346靶向miR-138-5p在海拉細(xì)胞的增殖凋亡中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

綜上，本研究明確了lncRNA LINC00346在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，在宮頸癌海拉細(xì)胞中l(wèi)ncRNA LINC00346靶向miR-138-5p調(diào)控宮頸癌海拉細(xì)胞增殖和凋亡。lncRNA LINC00346可能是宮頸癌潛在的分子靶點。