膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液和滑膜中微小RNA-140-5p的表達及臨床意義

張海英，鄭晨穎

骨關(guān)節(jié)炎是多發(fā)于中老年的退行性疾病，隨著人口老齡化的加劇，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有持續(xù)上升的趨勢，骨關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)疼痛、活動功能受限等為臨床表現(xiàn)，嚴重影響病人日常生活質(zhì)量，目前發(fā)病機制尚未闡明［1］。當前骨關(guān)節(jié)炎診斷主要依靠以軟骨形態(tài)學變化為基礎(chǔ)的磁共振成像、超聲檢查及關(guān)節(jié)鏡技術(shù)，存在滯后性、創(chuàng)傷性等限制，確診時骨關(guān)節(jié)炎病人關(guān)節(jié)軟骨往往已經(jīng)發(fā)生不同程度損傷，因此尋找骨關(guān)節(jié)炎的有效早期診斷指標對于早期干預以延緩病情，預防關(guān)節(jié)發(fā)生不可逆的退變是非常重要的［2-3］。微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是機體內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因的表達，與多種自身免疫疾病有關(guān)，已有研究表明miR-140-5p在關(guān)節(jié)炎病人外周血、關(guān)節(jié)液中表達異常［4-5］，膝骨關(guān)節(jié) 炎（knee osteoarthritis，KOA）病人滑膜中的miR-140-5p的研究較少。本研究旨在探討KOA病人關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料選取北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院2018年5月至2019年5月收治的51例進行膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)鏡或關(guān)節(jié)置換術(shù)治療的KOA病人為觀察組，年齡范圍為41～75歲。依據(jù)凱爾格倫-勞倫斯（Kell‐gren-Lawrence，K-L）X線影像學分級標準將觀察組分為3個亞組：KOAⅡ組（12例）、KOAⅢ組（24例）、KOAⅣ組（15例），其中Ⅱ級為明確骨贅；Ⅲ級為多發(fā)骨贅，伴關(guān)節(jié)間隙中度變窄；Ⅳ級為巨大骨贅，伴關(guān)節(jié)間隙嚴重變窄及軟骨下骨硬化［6］。納入標準：（1）符合中華醫(yī)學會制定的KOA診斷標準［7］；（2）K-L分級為Ⅱ～Ⅳ級；（3）近3個月未經(jīng)藥物治療；（4）近3個月無膝關(guān)節(jié)外傷。排除標準：（1）合并心、肝、腎等重要器官疾病者；（2）合并其他自身免疫性疾病者；（3）妊娠、哺乳期婦女。另外選取在該院進行截肢手術(shù)或因急性損傷進行關(guān)節(jié)鏡治療的55例無骨關(guān)節(jié)炎病人作為對照組，年齡范圍為43～73歲。觀察組、對照組均于術(shù)中收集關(guān)節(jié)液及滑膜，所有標本均在手術(shù)室進行預處理，后置于?80℃超低溫冰箱中保存待測。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測關(guān)節(jié)液和滑膜中miR-140-5p（儀器：Roche LightCycler 480Ⅱ型）。關(guān)節(jié)液離心（2 000 r/min，10 min）去除細胞與組織碎片，上清液于?80℃保存待測；術(shù)中收集的滑膜放入無菌管中，置入液氮中速凍，后在?80℃超低溫冰箱保存待測。采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cD‐NA），進行擴增反應，反應條件：95℃預變性30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)，miR-140-5p正向引物：5'-TGTGTCTCTCTCTGTGTCCTG-3'，反向引物：5'-GGTATCCTGTCCGTGGTTCTA-3'，U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AAC‐GCTTCACGAATTTGCGT-3'，試劑盒均購于上海生工生物工程有限公司，嚴格按照說明書操作。用2?ΔΔCt法計算關(guān)節(jié)液和滑膜中miR-140-5p的表達。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以±s表示，兩組間差異比較采用兩獨立樣本t檢驗，三組間差異比較采用單因素方差分析，進一步多組間的兩兩比較采用LSD法；計數(shù)資料以例表示，采用χ2檢驗比較；采用Spearman相關(guān)性分析檢驗兩變量的相關(guān)關(guān)系；采用受試者工作特征（ROC）曲線探討關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p對KOA的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組一般資料比較兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 對照組（無骨關(guān)節(jié)炎）與觀察組（膝骨關(guān)節(jié)炎）一般資料比較

2.2兩組關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p表達比較對照組關(guān)節(jié)液和滑膜中miR-140-5p表達量分別為（1.08±0.38）、（1.54±0.35），觀察組關(guān)節(jié)液和滑膜中miR-140-5p表 達 量 分 別 為（0.51±0.16）、（0.67±0.21）。與對照組相比，觀察組關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p表達均較低（t=8.88，P<0.001；t=15.37，P<0.001）。

2.3觀察組各亞組關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p表達比較與KOAⅡ組相比，KOAⅢ組、KOAⅣ組關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p均較低（P<0.05），與KOAⅢ組相比，KOAⅣ組關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p均較低（P<0.05），見表2。

表2 觀察組（膝骨關(guān)節(jié)炎）各亞組關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p表達比較/±s

表2 觀察組（膝骨關(guān)節(jié)炎）各亞組關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p表達比較/±s

注：KOA為膝骨關(guān)節(jié)炎。①與KOAⅡ組相比，P<0.05。②與KOAⅢ組相比，P<0.05。

組別KOAⅡ組KOAⅢ組KOAⅣ組F值P值例數(shù)12 24 15 miR-140-5p關(guān)節(jié)液0.65±0.17 0.51±0.14①0.42±0.12①②8.77 0.001滑膜0.86±0.22 0.69±0.15①0.49±0.13①②17.33<0.001

2.4KOA病人關(guān)節(jié)液、滑膜miR-140-5p與K-L分級相關(guān)性分析Spearman分析結(jié)果顯示，KOA病人關(guān)節(jié)液、滑膜miR-140-5p與K-L分級均呈負相關(guān)（r=?0.56，P<0.001；r=?0.68，P<0.001）。

2.5關(guān)節(jié)液、滑膜miR-140-5p對KOA的診斷價值ROC結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)液、滑膜miR-140-5p診斷KOA的曲線下面積（AUC）95%CI分別為0.913（0.855，0.972）、0.931（0.873，0.988），截斷值分別是0.78、1.05，靈敏度、特異度、準確度、約登指數(shù)、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比分別為98.04%、78.18%、87.74%、0.76、80.65%、97.73%、4.49、0.03，96.08%、89.09%、92.45%、0.85、89.09%、96.08%、8.81、0.04。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎以軟骨退變、滑膜炎癥為主要特點，發(fā)病呈進行性發(fā)展，KOA是最常見類型［8-9］。軟骨組織由軟骨細胞、軟骨細胞外基質(zhì)組成，KOA的病理過程主要是關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)合成與降解功能失衡，引起軟骨細胞凋亡，最終導致軟骨退變、丟失及軟骨下骨硬化［10］。軟骨細胞外基質(zhì)由軟骨組織唯一細胞類型軟骨細胞表達分泌，主要由蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白組成，對軟骨維持正常功能起重要作用，已有研究表明骨關(guān)節(jié)炎病人基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13呈高表達，對蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白有強降解功能，帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶-5（a disinterring and me‐talloproteinase with thrombospondin motifs 5，AD‐AMTS-5）在降解蛋白聚糖中起到重要作用［11-12］。有研究從RNA表達層面對KOA的發(fā)病機制作出闡述，報道表明β-連環(huán)素（β-catenin）與核因子-κB（NF-κB）信號通路可能通過共同調(diào)控下游炎性因子白細胞介素（IL）-1β的表達參與滑膜炎癥反應［13］。

miRNAs可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達參與機體炎癥反應、腫瘤、心血管疾病等，一個miRNA可調(diào)控多達上百個靶基因的表達［14］。已有研究表明miR‐NA在多種類型關(guān)節(jié)炎病人中呈異常表達［4，15-16］，miR-140由miR-140-3p、miR-140-5p組成，具有調(diào)控軟骨穩(wěn)態(tài)的作用，與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)［5］。韓朝永［17］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比，KOA病人關(guān)節(jié)液中miR-140呈低表達，與K-L分級存在相關(guān)性。殷春明、潘曉華［18］研究表明，miR-140-3p參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，與病情發(fā)展呈負相關(guān)?；こ衫w維細胞的主要生理作用是為關(guān)節(jié)腔提供營養(yǎng)物質(zhì)，以及為周圍軟骨提供潤滑環(huán)境，類風濕關(guān)節(jié)炎病人滑膜增生、炎性因子過量蓄積。程龍等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在體外將miR-140-5p以脂質(zhì)體2000為載體轉(zhuǎn)染到類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞中，滑膜成纖維細胞的促炎性因子Toll樣受體4表達降低，致使滑膜成纖維細胞增殖及侵襲能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，觀察組關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p均呈低表達；KOAⅡ組、KOAⅢ組、KOAⅣ組相比，關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p表達均依次降低；Spearman相關(guān)性分析顯示，KOA病人關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p的表達與K-L分級均呈負相關(guān)，提示關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p與KOA病程發(fā)展密切相關(guān)，可能成為KOA的生物標志物、治療新靶點，分析原因是miR-140-5p可能通過靶向調(diào)控軟骨細胞外基質(zhì)降解因子MMP-13、ADAMTS-5的表達［20］，參與KOA的發(fā)生、發(fā)展。MMP-13、ADAMTS-5與KOA的研究廣泛。祁雷等［21］研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-13、ADAMTS-5表達均呈現(xiàn)先升高后降低現(xiàn)象，與軟骨退化過程密切相關(guān)。黃愷等［22］研究發(fā)現(xiàn)，與注射0.9%氯化鈉注射液的兔骨關(guān)節(jié)炎模型相比，經(jīng)黃連素治療的模型軟骨病變程度較輕，軟骨組織中MMP-13、ADAMTS-5表達均較低，蛋白聚糖、Ⅱ型膠原表達較高。滑膜的退行性病變也是KOA的重要病理變化。羊鵬飛等［23］研究表明，非骨關(guān)節(jié)炎病人、輕度骨關(guān)節(jié)病人、中度骨關(guān)節(jié)病人相比，滑膜組織中MMP-3、半乳糖凝集素3陽性表達率依次升高，與中度骨關(guān)節(jié)炎病人相比，中度骨關(guān)節(jié)炎病人滑膜組織中半乳糖凝集素3陽性表達率較高。MMP-3、半乳糖凝集素3陽性表達率均與隨病情加重而增加，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及病情發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究中，ROC結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)液、滑膜miR-140-5p診斷KOA的AUC 95%CI分別為0.913（0.855，0.972）、0.931（0.873，0.988），截斷值分別是0.78、1.05，靈敏度、特異度、準確度、約登指數(shù)、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比分別為98.04%、78.18%、87.74%、0.76、80.65%、97.73%、4.49、0.03，96.08%、89.09%、92.45%、0.85、89.09%、96.08%、8.81、0.04，可見關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p對KOA均有一定診斷價值，或可成為臨床潛在診斷指標。

綜上所述，KOA病人與非關(guān)節(jié)炎對照相比，關(guān)節(jié)液、滑膜中miR-140-5p均呈低表達，與K-L分級均呈負相關(guān)，miR-140-5p可能成為KOA的臨床監(jiān)測指標以及治療靶點，具體調(diào)節(jié)機制尚需進一步研究探討。