中性粒細(xì)胞胞外陷阱、炎性蛋白水平對(duì)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢深靜脈血栓形成預(yù)測(cè)價(jià)值分析

鄭桂蓮，耿曉慧，張莎莎，王茜，高文香

下肢深靜脈血栓形成（DVT）是全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的常見并發(fā)癥之一，若無任何形式的預(yù)防措施，DVT的發(fā)生率高達(dá)50%～60%，可能誘發(fā)肺栓塞等，威脅病人生命安全，因此早期識(shí)別DVT的危險(xiǎn)因素，并預(yù)測(cè)DVT發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)意義重大。動(dòng)物學(xué)研究表明，給予肽?；彼崦搧啺泵?破壞中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs），可降低動(dòng)脈損傷小鼠動(dòng)脈內(nèi)膜損傷的程度與急性血栓并發(fā)癥的發(fā)生，提示NETs與急性血栓類疾病的發(fā)生有關(guān)［1］。C反應(yīng)蛋白（CRP）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α（MIP-1α）是兩種炎性蛋白［2］。根據(jù)以往資料，低CRP與高CRP病人外周血脂蛋白相關(guān)凝血抑制物水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CRP與凝血功能有關(guān)，而MIP-1α被證實(shí)與糖尿病微血管病變、血栓形成密切相關(guān)［3-4］。但NETs、CRP、MIP-1α在全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢DVT中的研究較少?；诖耍狙芯渴状翁接慛ETs、CRP、MIP-1α對(duì)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢DVT預(yù)測(cè)價(jià)值，旨在為臨床提供參考依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取河南省洛陽正骨醫(yī)院2018年1月至2019年6月全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)病人110例，根據(jù)是否伴有DVT分為觀察組36例（DVT病人）及對(duì)照組74例（無DVT病人）。所有病人術(shù)后均出現(xiàn)下肢疼痛、皮膚顏色異常等疑似DVT癥狀，DVT診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南（第二版）》［5］。確診后給予常規(guī)抗DVT治療。入組者均對(duì)該研究知情，自愿簽署知情同意書。該研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2納入、排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：于該院行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)病人；觀察組符合DVT診斷標(biāo)準(zhǔn)；圍手術(shù)期無發(fā)熱等感染跡象或感染疾??；無認(rèn)知功能障礙；檢測(cè)配合度良好；入組前3個(gè)月無急性腦梗死、心肌梗死。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并白血病者；長(zhǎng)期應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑及影響凝血功能藥物者；有精神病史者；術(shù)后傷口有紅腫或淺表感染者；凝血功能異常者。

1.3標(biāo)本采集與檢測(cè)（1）主要試劑、儀器：低溫高速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)（美國Thermo）；低速離心機(jī)（日本KUBOTA）；移液器（法國Gilson）；anti-MPO monoclonal capture antibody（美國ABD Serotec）；per‐oxidase substrate（ABTIS）、顯色劑（TMB）、peroxi‐dase-labeled anti-DNA monoclonal antibody（德國Ro‐hce）；CRP試劑盒（艾美捷科技有限公司）；MIP-1α試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆?。

（2）兩組術(shù)前12 h均給予低分子肝素（深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20060190）100U/kg，皮下注射，術(shù)后每日皮下注射1次，100 U/kg，共注射3次。術(shù)前、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d分別采集空腹肘部靜脈血5 mL，3 000 r/min，離心15 min，上清置入EP管中，保存于?80℃。采用MPO-DNA復(fù)合物的捕獲酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)NETs。96孔板中，加入75μg濃度為5 mg/L anti-MPOmonoclonal capture antibody于每孔，4℃冰箱中過夜。次日取出96孔板，棄去孔內(nèi)液，加入300μL洗滌液，重復(fù)3次。加入1%牛血清白蛋白（BSA）125μL于每孔進(jìn)行封閉。棄去孔內(nèi)液，加入300μL洗滌液，重復(fù)3次。每孔加入20μL血清與80μL含有peroxidase-la‐beled anti-DNA monoclonal antibody的反應(yīng)緩沖液（稀釋比為1∶25），室溫下，300 r/min搖96孔板2 h。棄去孔內(nèi)液，加入300μL洗滌液，重復(fù)3次。加入100μL顯色劑，室溫下避光反應(yīng)0.5 h，加入終止液，405 nm波長(zhǎng)位置記錄吸光度。

（3）通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清CRP、MIP-1α水平。實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液100μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育90 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，不用洗板，每孔中加入生物素化抗體工作液100μL（在使用前20 min內(nèi)配制），給酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1 h。棄去液體，洗板3次，每次浸泡30 s，大約350微升/孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前20 min內(nèi)配制，避光放置）100μL，加上覆膜，37℃溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每孔加顯色劑（TMB）90μL，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光孵育15 min。每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度。分別以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本吸光度在曲線上計(jì)算出各指標(biāo)濃度。

1.4觀察指標(biāo)（1）比較兩組一般資料。（2）比較兩組血清NETs、CRP、MIP-1α水平。（3）分析全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢DVT的危險(xiǎn)因素。（4）分析血清NETs、CRP、MIP-1α單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)下肢DVT的效能參數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用logistic逐步回歸法分析DVT發(fā)生的影響因素，受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）分析各指標(biāo)預(yù)測(cè)DVT的價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組一般資料兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、合并內(nèi)科疾病比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)病人一般資料比較

2.2兩組血清NETs、CRP、MIP-1α水平觀察組術(shù)后1 d、術(shù)后3 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平高于對(duì)照組（P<0.05），見表2。

表2 兩組全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)病人血清NETs、CRP、MIP-1α水平/±s

表2 兩組全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)病人血清NETs、CRP、MIP-1α水平/±s

注：NETs為中性粒細(xì)胞胞外陷阱，CRP為C反應(yīng)蛋白，MIP-1α為巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α。

組別對(duì)照組術(shù)前術(shù)后1 d術(shù)后3 d觀察組術(shù)前術(shù)后1 d術(shù)后3 d組間t，P值術(shù)前術(shù)后1 d術(shù)后3 d例數(shù)74 36 NETs（吸光度）0.19±0.06 0.38±0.13 0.37±0.13 0.20±0.08 0.52±0.16 0.26±0.08 0.73，0.465 4.91，<0.001 5.47，<0.001 CRP/（mg/L）10.58±2.69 25.28±8.42 13.16±4.37 10.26±2.34 35.27±11.74 19.64±6.55 0.61，0.543 5.11，<0.001 6.16，<0.001 MIP-1α/（ng/L）10.90±2.81 26.63±8.84 15.22±5.10 11.34±3.15 38.09±12.68 21.07±7.02 0.74，0.461 5.51，<0.001 4.97，<0.001

2.3全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢DVT的影響因素以全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后是否有下肢DVT作為因變量（0=否，1=是），年齡（1=≤60歲，2=>60歲）、合并內(nèi)科疾?。?=無，1=有）、BMI（1=≤24 kg/m2，2=>24 kg/m2）、術(shù)后3 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平作為自變量（多重共線性診斷結(jié)果提示術(shù)后1 d、3 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平可能存在多重共線性，同時(shí)術(shù)后1d由于創(chuàng)傷、疼痛產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)可能會(huì)對(duì)各指標(biāo)變化造成較大影響，故將術(shù)后1 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平予以剔除），進(jìn)行l(wèi)ogistic逐步回歸分析，結(jié)果顯示，年齡、合并內(nèi)科疾病、BMI、術(shù)后3 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平是全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢DVT的獨(dú)立影響因素（P<0.05），見表3。

表3 全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢深靜脈血栓形成（DVT）的影響因素

2.4血清NETs、CRP、MIP-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)下肢DVT的預(yù)測(cè)價(jià)值術(shù)后3 d血清CRP預(yù)測(cè)下肢DVT的靈敏度最高，而術(shù)后3 d聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)下肢DVT的特異度、準(zhǔn)確度、約登指數(shù)和AUC值最高，見表4。

表4 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)病人術(shù)后下肢深靜脈血栓形成（DVT）預(yù)測(cè)的效能參數(shù)

3 討論

全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT發(fā)生率較高，如何防治DVT成為臨床研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。劉宏煒等［6］報(bào)道指出，高齡、患有糖尿病是DVT發(fā)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素。該研究顯示，除以上因素外，血清NETs、CRP、MIP-1α水平是全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢DVT的重要影響因素，與DVT發(fā)生密切相關(guān)，可為臨床針對(duì)性篩查DVT高危人群提供參考。

NETs由活化的中性粒細(xì)胞釋放及組蛋白、中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)顆粒組成的細(xì)胞外小段DNA結(jié)構(gòu)，具有抗微生物特性，在結(jié)扎小鼠下腔靜脈血栓小鼠模型外周循環(huán)中的表達(dá)高于正常小鼠［7-8］。而預(yù)先通過脫氧核糖核酸酶降解DNA成分去除NETs后，小鼠靜脈血栓形成明顯改善［9］。該研究顯示，DVT病人術(shù)后1 d、術(shù)后3 d血清NETs水平高于無DVT病人，表明NETs與DVT發(fā)生有關(guān)，調(diào)控DVT高風(fēng)險(xiǎn)人群NETs或從基因水平靶向NETs有助于預(yù)防DVT的發(fā)生。薛龍等［10］研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后NETs水平與全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢DVT具有相關(guān)性，支持該研究結(jié)論。NETs在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面大量聚集之后，可啟動(dòng)與內(nèi)皮細(xì)胞、血小板間的反應(yīng)，并結(jié)合Ⅻ因子和VWF等，促進(jìn)纖維蛋白形成、紅細(xì)胞與血小板聚集，加快血液凝固，且NETs還能為靜脈血栓形成提供纖維樣骨架結(jié)構(gòu)，故可影響DVT的發(fā)生［11-12］，可為臨床預(yù)測(cè)DVT的發(fā)生提供量化參考。

CRP系細(xì)胞膜糖蛋白，主要由肝臟合成。鄭春蓮等［13］報(bào)道顯示，DVT病人治療前CRP較高，而治療后CRP降低，并伴有病情的改善，提示CRP與DVT有關(guān)。該研究顯示，DVT病人術(shù)后1 d、術(shù)后3 d血清CRP水平高于無DVT病人，表明CRP與DVT發(fā)生有關(guān)，調(diào)控CRP或從基因水平靶向CRP，可能為DVT的防治提供了一個(gè)潛在新思路。佟冰渡等［14］研究發(fā)現(xiàn)，DVT病人自術(shù)后第3天開始，CRP持續(xù)高于非DVT病人，從側(cè)面論證了該研究結(jié)論。CRP可刺激誘導(dǎo)機(jī)體單核細(xì)胞分泌組織因子、炎癥遞質(zhì)，損傷血管內(nèi)皮，介導(dǎo)血小板凝聚，并引起人體內(nèi)皮細(xì)胞合成凝血因子，啟動(dòng)凝血瀑布樣反應(yīng)，從而影響DVT的發(fā)生［15-16］，可為臨床預(yù)測(cè)DVT發(fā)生選取合適的指標(biāo)提供參考。

MIP-1α主要由成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)［17-18］。注射MIP-1α抗體誘導(dǎo)MIP-1α的耗竭，可減小小鼠模型的血栓，提示MIP-1α可能與血栓形成有關(guān)［19］。該研究顯示，MIP-1α在DVT中表達(dá)高于無DVT病人，表明MIP-1α可影響DVT的發(fā)生，抑制MIP-1α表達(dá)有助于減少高風(fēng)險(xiǎn)人群DVT的發(fā)生。且術(shù)后3 d MIP-1α預(yù)測(cè)DVT發(fā)生的AUC達(dá)0.737，截?cái)嘀?18.57 ng/L時(shí)，靈敏度為0.667，特異度為0.730，可為臨床提供量化的參考信息。結(jié)合文獻(xiàn)分析，MIP-1α可趨化單核細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞向損傷部位遷移，誘發(fā)炎癥反應(yīng)與血小板在損傷部位的聚集，從而增加DVT發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

現(xiàn)階段全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT的評(píng)估常采用超聲檢查、凝血功能檢查等，但多在發(fā)生后方可明確，不利于DVT的預(yù)防。有研究報(bào)道，MIP-1α預(yù)測(cè)老年臥床靜脈血栓栓塞癥的AUC為0.739［20］，與該研究MIP-1α的AUC相似。且該研究還發(fā)現(xiàn)，NETs、CRP、MIP-1α能預(yù)測(cè)DVT的發(fā)生，且在術(shù)后3 d進(jìn)行三者的聯(lián)合預(yù)測(cè)具有更高的特異度、準(zhǔn)確度、約登指數(shù)和AUC值，可防患于未然，盡早采取有針對(duì)性的預(yù)防措施，以減少或避免DVT的發(fā)生，為臨床預(yù)防DVT提供客觀數(shù)據(jù)與循證支持，而選擇術(shù)后3 d各指標(biāo)變化進(jìn)行預(yù)測(cè)，也在一定程度降低了術(shù)后早期由于創(chuàng)傷引起的各指標(biāo)應(yīng)激性升高而導(dǎo)致的假陽性率升高的可能。但不足之處在于，納入樣本量較少，可能造成數(shù)據(jù)的偏倚，仍需后續(xù)增加病例數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步地驗(yàn)證、完善。

綜上所述，NETs、CRP、MIP-1α在全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT病人中呈高表達(dá)，與DVT發(fā)生顯著相關(guān)，并對(duì)DVT發(fā)生具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，尤其是三者聯(lián)合檢測(cè)具有更高的預(yù)測(cè)效能。靶向NETs、CRP、MIP-1α可能為防治DVT提供了一個(gè)新思路。