趙永艷,劉瑩瑩,吳勝英
血管性癡呆主要繼發(fā)于缺血性腦血管病,根據病因、病變腦組織的部位、起病的形式可分為急性血管性癡呆、亞急性或慢性血管性癡呆[1]。血栓脫落引起的栓塞、血液動力學改變或任何可導致頸動脈與椎-基底動脈供血不足均可造成大腦行為、記憶及認知功能區(qū)低灌注,導致腦組織缺血缺氧并最終使大腦功能全面衰退,造成血管性認知損害,表現為包括記憶、認知、情緒、行為等癥狀與體征改變的綜合征,且這種獲得性智能損害常持續(xù)數月或半年以上[2-3]。血管性癡呆與年齡增長呈正相關,故積極探討其發(fā)病機制、尋找有效的治療藥物和方法意義重大。養(yǎng)血清腦顆粒具有活血通絡、滋陰養(yǎng)血、平肝潛陽之功效,在臨床治療血管性癡呆等已有應用,可顯著改善患者記憶、認知、情緒和行為能力[4]。目前有研究證實其主要通過增高5-羥色胺、腦源性神經營養(yǎng)因子和神經生長因子蛋白含量來改善臨床癥狀[5-6]。但對反映疾病嚴重程度的血清S100B蛋白(S100B)和及腦功能恢復密切相關的血管內皮生長因子(VEGF)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)及β-連環(huán)素(β-catenin)的表達缺少相關研究。本研究起止時間為2019年2—6月,采用兩血管阻斷法制作大鼠血管性癡呆模型,每日用養(yǎng)血清腦顆粒灌胃治療,觀察其對腦海馬CA1區(qū)VEGF、β-catenin和GFAP蛋白表達的影響,借此探討可能機理,為臨床用藥提供實驗依據。
1.1實驗動物清潔級SD大鼠36只,雄性,體質量范圍為165~175 g,購自湖北省醫(yī)學實驗動物繁育中心,飼養(yǎng)于十堰市太和醫(yī)院科研中心標準實驗室,實驗動物生產許可證:SCXK(鄂)2016-0008,實驗動物使用許可證:SYXK(鄂)2016-031。本研究符合一般動物實驗倫理學原則,實驗遵守3R原則,滿足動物福利。術后常規(guī)飼養(yǎng)標準嚙齒類動物飼料,自由進食、飲水。實驗室濕度60%~75%,室溫(22±2)℃,12 h/12 h明暗交替光照。
1.2儀器和試劑高效液相色譜儀購自上海彬合物資有限公司(UltiMate 3000型);水合氯醛購自武漢博萊特化工有限公司;養(yǎng)血清腦顆粒購自天津天士力制藥股份有限公司(批號0170822);VEGF和S100BELISA試劑盒由上海仁捷生物科技有限公司提供;兔抗大鼠β-catenin多克隆抗體由北京博奧森生物公司提供;DAB和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)低分子質量標準蛋白顯色液由北京中杉生物有限公司提供;5-羥色胺標準品購自Aladdin;色譜純乙腈、甲醇、甲酸(Thermo Fisher Scientific);ELISA試劑盒由北京華英生物技術研究所提供。
1.3血管性癡呆模型制備及納入標準模型制備參照劉偉等[7]兩血管阻斷法建模:造模前適應性飼養(yǎng)1周。將其中24只于手術前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,待動物麻醉后,仰臥位固定四肢和頭部,剪去頸部鼠毛并消毒,切開頸部皮膚,分離雙側頸內動脈,后用動脈夾將大鼠雙側頸總動脈夾閉10min后再通10 min,反復3次即可縫合傷口[7]。納入標準:大鼠術后2 h左右會清醒,以行走向一側傾倒、轉圈,靜止和提尾時向一側前肢蜷曲,Zea Longa神經行為學評分[8]在1~4分之間為入選標準,評分為0和5分的棄去。本實驗無動物死亡,24只均成模。
1.4分組及治療方法先將養(yǎng)血清腦顆粒配制成6.4%的混懸液備用。然后將經以上兩血管阻斷法制作的24只血管性癡呆模型采用隨機數字表法分為模型組和實驗組(n=12),另12只未手術的設為對照組,對照組不進行建模手術。實驗組在術后1周時皮膚均愈合,每天按20 mL·kg?1·d?1劑量,分2次灌胃給予6.4%的養(yǎng)血清腦顆粒混懸液,治療3周,模型組和對照組灌等體積生理鹽水對照,模型組和對照組灌等體積生理鹽水對照。
1.5檢測指標及方法
1.5.1Morris水迷宮實驗 治療3周后用WMT-100型Morris水迷宮分析系統(tǒng)進行定位航行試驗測試逃避潛伏期,空間探索實驗測試60 s內穿越平臺次數,結合Zea Longa神經行為學評分評定大鼠學習和記憶能力。
1.5.2血清S100B檢測方法 治療3周后,分別斷尾,取0.2 mL尾靜脈血備用,采用免疫吸附法檢測靜脈血清S100B蛋白含量。
1.5.35-羥色胺檢測方法 檢測前配制人工腦脊液(氯化鈉7.247 g,氯化鉀0.224 g,氯化鈣0.222 g,硫酸鎂0.493 g,碳酸氫鈉2.184 g,葡萄糖0.6 g,磷酸二氫鈉0.193 g,溶于蒸餾水1 000 mL),通95%氧氣+5%二氧化碳飽和后置于4℃冰箱備用。Morris水迷宮實驗結束后,將大鼠斷頭處死,迅速分離出腦組織,放入人工腦脊液中,小心分離出海馬CA1區(qū)組織凍存。檢測時取出,室溫解凍,取200μL水與甲醇混合液(比例為1∶1),將標本放入、振蕩、勻漿、瞬離,抽取組織勻漿上清液100μL于離心管,加入200μL乙腈后渦旋(5 min),高速離心5 min(4℃,14 000 r/min),取上清加樣檢測,采用高效液相色譜-質譜技術(HPLC-MS)法檢測腦組織海馬CA1區(qū)組織中5-羥色胺含量。
1.5.4免疫組化 取凍存腦組織,石蠟包埋,切片,烤干,脫蠟,采用ELISA放射免疫方法檢測腦組織VEGF含量;切片經免疫組織化學染色后檢測GFAP和β-catenin蛋白陽性表達。免疫組化方法嚴格按試劑說明書具體操作步驟按進行。GFAP和βcatenin蛋白免疫組化陽性標準:光學顯微鏡下,細胞胞漿和胞核均呈棕黃色。組織切片采用攝像顯微鏡攝像,選擇各組大鼠海馬CA1區(qū)不重疊的6個視野,應用數碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分別進行GFAP和β-catenin陽性細胞計數。
1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。以±s表示計量資料,多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。因Zea Longa評分和VEGF不滿足方差齊性假設,多組間兩兩比較采用非齊性條件下的Games-Howell檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1大鼠空間探索試驗、定位航行及ZeaLonga評分比較除Zea Longa評分不滿足方差齊性分析外,其他檢測值均滿足方差齊性。其中在Morris水迷宮空間探索試驗中,模型組大鼠在撤去平臺60 s時間內跨越平臺次數明顯減少,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在定位航行試驗中,模型組逃避潛伏期明顯延長,Zea Longa行為學評分分值提高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組大鼠則相反,其60 s時間內跨越平臺次數明顯增多、逃避潛伏期明顯縮短,Zea Longa評分較模型組明顯降低,與模型組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因Zea Longa評分不滿足方差齊性假設,采用非齊性條件下的Games-Howell檢驗,結果顯示任意兩組之間均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
表1 大鼠空間探索試驗、定位航行及Zea Longa神經行為學評分比較/±s
表1 大鼠空間探索試驗、定位航行及Zea Longa神經行為學評分比較/±s
注:①與對照組比較,P<0.05。②與模型組比較,P<0.05。
組別對照組模型組實驗組F值P值鼠數12 12 12穿臺次數/次6.05±0.27 2.92±0.14①5.75±0.39①②440.38<0.001逃避潛伏期/s 41.24±3.49 86.95±6.34①42.57±3.20①②388.56<0.001 Zea Longa/分0.04±0.00 3.84±0.31①1.91±0.21①②904.13<0.001
2.2大鼠所測各項指標比較除CA1區(qū)VEGF不滿足方差齊性外,其他檢測值均滿足方差齊性。其中模型組血清S100B及腦海馬CA1區(qū)GFAP蛋白表達均增多、腦海馬CA1區(qū)5-羥色胺含量降低,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),腦海馬CA1區(qū)VEGF、β-catenin蛋白表達增多,但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);而治療后實驗組S100B和GFAP蛋白明顯降低,5-羥色胺含量及CA1區(qū)VEGF和β-catenin蛋白表達均增多,與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因CA1區(qū)VEGF不滿足方差齊性假設,采用非齊性條件下的Games-Howell檢驗,結果顯示對照組與實驗組、模型組與實驗組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),對照組與模型組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。
表2 大鼠各項指標比較/±s
表2 大鼠各項指標比較/±s
注:S100B為血清S100B蛋白,GFAP為膠質纖維酸性蛋白,β-catenin為β-連環(huán)素,VEGF為血管內皮生長因子。①與對照組比較,P<0.05。②與模型組比較,P<0.05。
組別對照組模型組實驗組F值P值鼠數12 12 12 S100B/(mg/L)2.41±0.21 5.29±0.37①2.85±0.34①②297.22<0.001 5-羥色胺/(μg/L)0.74±0.09 0.51±0.05①0.73±0.09②33.03<0.001 GFAP/(個/高倍視野)10.84±0.89 35.53±2.18①21.45±1.49①②712.27<0.001 β-catenin/(個/高倍視野)9.97±1.09 10.08±1.20 12.40±1.56①②13.37<0.001 VEGF/(mg/L)150.59±7.53 151.82±7.35 193.25±16.34①②56.19<0.001
現代醫(yī)學研究認為,血管性癡呆與神經遞質5-羥色胺、多巴胺等有關,因其是中樞神經系統(tǒng)重要神經遞質,對高級神經功能具有重要調節(jié)作用,其在神經元含量下降可導致學習記憶障礙[9]。在本實驗中模型組腦海馬CA1區(qū)5-羥色胺含量低于對照組,大鼠平均逃避潛伏期明顯延長,跨越平臺次數減少,Zea Longa評分也明顯高于對照組。這一方面提示血管性癡呆建模成功,同時也證實腦海馬CA1區(qū)5-羥色胺含量降低影響到學習記憶功能。有研究表明,腦組織缺血與血管性癡呆的發(fā)生發(fā)展密切相關,腦組織缺血低氧性低灌注會直接或間接損傷海馬區(qū)神經元,引起腦海馬CA1區(qū)神經元損傷甚至突觸丟失,從而導致學習和記憶功能障礙[10]。Wnt/β-catenin信號通路參與神經元的發(fā)育,而β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的重要調節(jié)因子,調節(jié)DNA轉錄和細胞核內靶基因的表達[11]。血管新生對腦損傷修復起到促進作用,而VEGF是促進血管新生的主要調節(jié)因子,通過調節(jié)受損血管內皮細胞的遷移和增殖,從而改善血管內皮細胞功能、修復受損神經元[12]。因此,通過干預β-catenin和VEGF等調節(jié)因子可能影響血管性癡呆病理過程。本實驗中模型組腦海馬CA1區(qū)VEGF和β-catenin蛋白表達均低于正常對照組,說明夾閉大鼠雙側頸總動脈造成腦組織缺血而導致腦損傷,進而導致大鼠學習記憶功能障礙。而治療后,實驗組CA1區(qū)VEGF和β-catenin蛋白表達均增多,提示養(yǎng)血清腦顆粒能誘導血管性癡呆模型大鼠VEGF和β-catenin的表達。S100B蛋白主要分布于中樞神經系統(tǒng)中的樹突膠質細胞、星形膠質細胞和室管膜細胞,大量臨床檢測發(fā)現,腦卒中患者血清S100B蛋白濃度明顯提高,而高濃度的S100B參與神經退化的過程,產生的神經毒性作用可導致腦組織對缺血缺氧的敏感性增加,加劇神經元損傷及凋亡的風險,而經治療后S100B蛋白則顯著下降,說明S100B蛋白濃度變化與癡呆患者病情嚴重程度呈正相關[13]。另外,血管性癡呆與星形膠質細胞功能有關,而GFAP是星形膠質細胞的特征性標志物,故其在腦組織中表達可直接反映星形膠質細胞活化與增生狀況[14]。本實驗結果顯示,模型組血清S100B及腦海馬CA1區(qū)GFAP蛋白表達均增多,學習記憶能力的降低(大鼠平均逃避潛伏期明顯延長,跨越平臺次數減少,Zea Longa評分也明顯高于對照組);而治療后實驗組S100B和GFAP蛋白明顯降低,這一結果與董靜等[14]研究結果高度一致,這可能是養(yǎng)血清腦顆粒通過抑制星形膠質細胞活化、增生而發(fā)揮其對血管性癡呆的治療效應。
中醫(yī)學將血管性癡呆歸屬“癡證、善忘、不慧、愚癡、神呆”之范疇,表現為與智力有關的腦功能全面衰退為主的綜合癥候群[15]?,F代中醫(yī)將血管性癡呆分為腎虛髓虧、肝腎陰虛、瘀阻清竅、痰蒙清竅、心肝火旺、氣虛血瘀、心脾兩虛等七種基本證型,其中以腎虛髓虧貫穿整個血管性癡呆病程,其他證型兼并存在[16]。本研究認為,血管性癡呆具有本虛邪實的特點,病位以腎為主,其次為腦竅及心肝脾;病性以髓虧陰虛、氣虛為主;病因以瘀血、痰濁為主。因腎主藏精生髓,腎精充盈則髓海得養(yǎng),使人聰穎智慧;腦府失養(yǎng)、腎虛髓空則神情呆滯、反應遲鈍而愚癡,因此,在治療時應根據辨證分型有針對性地治療。如腎虛髓虧者可益腦填髓、補益肝腎;氣滯血瘀者可行氣活血、化瘀開竅;氣虛血瘀者當補氣活血、通絡開竅;心脾兩虛者當健脾養(yǎng)心、開竅醒神;痰濁阻絡者當健脾化痰、活血通絡;腎陽虛衰型當溫腎運脾、健腦醒神等,總之,血管性癡呆治療宜以清熱祛瘀、化痰開竅、益肝腎為總的治療原則[17]。
“養(yǎng)血清腦顆?!笔且灾嗅t(yī)名方“四物湯”改良研制的復方中藥制劑,由當歸、川芎、白芍、夏枯草、鉤藤、決明子、熟地黃、雞血藤、珍珠母、細辛、延胡索等多味中藥組成[18]。動物實驗表明,養(yǎng)血清腦顆粒可顯著改善血管性癡呆大鼠腦皮層微循環(huán)、增加癡呆大鼠腦血管血流量、抑制腦細胞凋亡、減輕缺血缺氧造成的缺血性腦損傷,明顯改善血管性癡呆大鼠學習記憶能力[19],本研究結果與其相符。養(yǎng)血清腦顆粒還可調節(jié)腦卒中大鼠血清中神經因子的含量,從而改善神經元的損害癥狀[20]。養(yǎng)血清腦顆粒具有補虛祛邪、活血養(yǎng)血、平肝潛陽、標本兼治的藥理特性,可調節(jié)神經遞質5-羥色胺及多巴胺合成,還可松弛動脈平滑肌、擴張全身小動脈、降低腦血管阻力并改善腦血流狀態(tài),從而發(fā)揮降低神經功能缺損程度的作用,在治療癡呆方面取得了一定的臨床療效[21-22]。從中醫(yī)藥理角度分析,養(yǎng)血清腦顆粒具有補益肝腎、益腦填髓的作用。方中當歸具活血化瘀通絡之功效,川芎主要成分川芎嗪和阿魏酸具行血中元氣、善行于頭面的藥效,二者均具有擴張血管、抗血小板聚集及改善微循環(huán)的作用;白芍主要成分白芍總苷具有抗血栓形成、抗炎、鎮(zhèn)痛、調節(jié)免疫等作用;另外,熟地黃補腎養(yǎng)血滋陰;珍珠母、決明子可平肝熄風止痙。雞血藤可補肝腎、益精壯陽,具有促進造血功能、免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠等藥理作用;珍珠母主平肝潛陽、安神、定驚明目;夏枯草清熱瀉火、明目,可散結消腫;細辛解表散寒、祛風止痛、通竅、溫肺化飲;延胡索活血、利氣、止痛,可行血中氣滯、氣中血滯。以上諸藥組成養(yǎng)血清腦顆粒方劑,在治療血管性癡呆上可起到補虛祛邪、養(yǎng)血滋陰、補益肝腎、活血通絡、平肝潛陽、益腦填髓的作用,使腦竅得以保養(yǎng),學習記憶能力提高,智力和運動功能得以部分恢復。實驗組60 s時間內跨越平臺次數明顯增多、逃避潛伏期明顯縮短,Zea Longa評分較模型組明顯降低,證實經養(yǎng)血清腦顆粒治療,大鼠學習記憶能力提高。
綜上所述,本實驗從血管活性物質、神經遞質和行為學等方面入手,結合養(yǎng)血清腦顆粒方劑中藥藥理作用,全面考察了養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠的治療作用。從實驗結果來看,養(yǎng)血清腦顆??赡芡ㄟ^上調β-catenin蛋白、促進VEGF和5-羥色胺合成、降低GFAP、改善腦組織血流狀態(tài)來發(fā)揮對血管性癡呆的治療作用。