小兒珍貝散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

汪安，程桂林，蒲婧哲，陶冶，王多梅

小兒珍貝散為兒童用藥，處方由牛黃、珍珠、川貝母、天竺黃、沉香、膽南星、煅硼砂、冰片共計(jì)八味藥材粉碎成細(xì)粉制得。具有清熱、消炎、止咳、化痰之功效［1-2］。其中，川貝母、沉香、人工牛黃、珍珠價(jià)格較高，市場(chǎng)上摻偽、以次充好現(xiàn)象較為常見(jiàn)。小兒珍貝散現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊(cè)》，標(biāo)準(zhǔn)只有性狀、理化鑒別和檢查項(xiàng)，難以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。2020年1—10月，本研究通過(guò)采用顯微鑒別、薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）建立了小兒珍貝散處方中珍珠、川貝母、沉香、人工牛黃四味藥定性和定量鑒別方法。所建立的方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，從而為完善小兒珍貝散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器Olympus BX51顯微鏡，島津高效液相色譜儀，配備SPD-20A紫外檢測(cè)器；CAMAG ATS4自動(dòng)點(diǎn)樣儀和TLC VISUALIZE薄層成像系統(tǒng)。Met‐tler ME204萬(wàn)分之一電子天平；KQ-100型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Millipore Simplicity-185型超純水儀（Millipore公司）。

1.2試藥牛膽粉對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)121095-201203）；沉香對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)121222-202104）；川貝母對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)121757-201609）；膽紅素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100077-201808，含量為98.9%）；甲酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純，美國(guó)Honeywell公司）。試劑：乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），實(shí)驗(yàn)中所用水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)樣品中成藥小兒珍貝散：企業(yè)A（批號(hào)K03002、K03001、B10016、B09013、B07011、B07010、B05009、B04007）；企 業(yè)B（批 號(hào)190301、200301、200201、190401、190301、180703、180402、180401、180101）；從亳州康美中藥材市場(chǎng)購(gòu)買牛黃、珍珠、川貝母、天竺黃、沉香、膽南星、煅硼砂、冰片藥材各1批，經(jīng)安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院張亞中博士鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1珍珠、川貝母、天竺黃、沉香顯微鑒別珍珠和川貝母的顯微特征參照《中國(guó)藥典》2020年版該品種項(xiàng)下；沉香參照《中藥粉末顯微鑒別彩色圖集》標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)各藥味顯微特征，增加小兒珍貝散顯微鑒別為：取本品，置顯微鏡下觀察：淀粉粒廣卵形、貝殼形、腎形或橢圓形，直徑約至60μm，臍點(diǎn)人字狀、星狀或點(diǎn)狀，層紋明顯（川貝母）。不規(guī)則碎塊，半透明，具彩虹樣光澤，有時(shí)可見(jiàn)細(xì)密波狀紋理（珍珠）。具緣紋孔導(dǎo)管，紋孔密，內(nèi)含淡黃色或黃棕色樹(shù)脂狀物（沉香）。

2.2薄層色譜

2.2.1人工牛黃［3-6］取樣品粉末0.3 g，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5 min，加甲醇至刻度，搖勻，靜置，取上清液，作為供試品溶液。取牛膽粉對(duì)照藥材10 mg，加甲醇適量，超聲處理使充分溶解，再加甲醇至10 mL，搖勻，靜置，取上清液，作為對(duì)照藥材溶液。根據(jù)處方組成，取除人工牛黃外的其余藥味，按工藝要求制成缺人工牛黃的陰性制劑。按供試品溶液制備方法，制得缺人工牛黃陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和上述對(duì)照藥材溶液各8μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-冰醋酸-水（7.5∶10∶0.3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。薄層圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 蛇莓薄層色譜圖：A為紫外光燈（365 nm）下；B為日光下

圖1 人工牛黃薄層色譜圖 圖2 沉香薄層色譜圖：2A為在紫外光燈（365 nm）下檢視；2B為在日光下檢視 圖3 川貝母薄層色譜圖

2.2.2沉香［7-8］取本品粉末0.5 g，置具塞試管中，加乙酸乙酯溶液3 mL，超聲處理60 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。另取沉香對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取除沉香外的其余藥味，按工藝要求制成缺沉香的陰性制劑。按供試品溶液制備方法，制得缺沉香陰性對(duì)照溶液。吸取上述三種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙醚（10∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；再噴以2%香草醛硫酸溶液，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。薄層圖譜見(jiàn)圖2。

2.2.3川貝母［9-11］取本品粉末約6 g，精密稱定，至圓底燒瓶中，加濃氨試液5 mL浸潤(rùn)，放置1 h，精密加入二氯甲烷-甲醇（4∶1）的混合溶液50 mL，混勻，置80℃水浴中加熱回流2 h，放冷，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL，搖勻，濾過(guò)，即得。另取川貝母對(duì)照藥材、川貝母藥材、湖北貝母、平貝母、浙貝母、伊犁貝母藥材，以及企業(yè)提供的川貝母原料藥材各1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取除川貝母外的其余藥味，按工藝要求制成缺川貝母的陰性制劑。按供試品溶液制備方法，制得缺川貝母陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（12∶10∶1）為展開(kāi)劑，二次展開(kāi)，取出，晾干，依次噴以稀碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉試液。供試品色譜中，在與川貝母對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。薄層圖譜見(jiàn)圖3。

2.3膽紅素HPLC含量測(cè)定［12-14］

2.3.1色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-1%冰醋酸溶液（95∶5）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm；柱溫35℃。進(jìn)樣量5μL。理論板數(shù)按膽紅素峰計(jì)算分別應(yīng)不低于3 000。對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺人工牛黃陰性對(duì)照溶液色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 膽紅素色譜圖（高效液相色譜法）：A為對(duì)照品溶液；B為供試品溶液（企業(yè)A，批號(hào)B09013）；C為缺人工牛黃陰性對(duì)照溶液

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 取膽紅素對(duì)照品適量，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度。精密量取1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得（每1毫升中含膽紅素4μg）。

2.3.3供試品溶液的制備 取本品1.5 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加二氯甲烷80 mL，超聲處理（功率180 W，頻率50 kHz）40 min，用二氯甲烷定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，去續(xù)濾液，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1專屬性試驗(yàn) 按處方比例及工藝制備缺人工牛黃陰性樣品，制備陰性樣品溶液，同供試品溶液制備方法操作，結(jié)果表明陰性樣品無(wú)干擾。

2.4.2耐用性試驗(yàn) 分別考察兩根不同商品規(guī)格的色譜柱和不同品牌液相色譜儀，測(cè)定同一批（B05009）樣品，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算膽紅素含量，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明耐用性試驗(yàn)良好。

表1 不同商品規(guī)格的色譜柱測(cè)定結(jié)果

2.4.3線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為0.4mg/L、1.6 mg/L、3.2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10μL注入高效液相色譜儀，以測(cè)得的峰面積Y為縱坐標(biāo)，膽紅素的進(jìn)樣濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到膽紅素進(jìn)樣量在0.004～0.160μg范圍內(nèi)，其進(jìn)樣量與峰面積之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=31 476X?984.42，R=0.999 9。

2.4.4精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”的膽紅素對(duì)照品溶液（濃度4 mg/L）5μL，按上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，膽紅素平均峰面積值為123 130.7，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為0.2%（n=6），表明方法精密度良好。

2.4.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（B05009）樣品6份，精密稱取1.5 g，分別置100 mL棕色容量瓶中，按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品中膽紅素的含量，其中膽紅素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD為0.9%，符合要求，表明方法重復(fù)性較好。

2.4.6準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知含量本品（批號(hào)B05009，膽紅素：0.518 1 mg/g）0.75 g，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，再精密加入濃度為0.102 4 g/L對(duì)照品溶液［精密稱取膽紅素對(duì)照品（含量98.9%）5.175 mg，至50 mL棕色量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液］4 mL，加二氯甲烷80 mL，超聲處理（功率180 W，頻率50 kHz）40 min，用二氯甲烷定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按擬訂方法平行測(cè)定6份，記錄色譜圖。求得總的膽紅素含量，根據(jù)樣品中已知的膽紅素含量和加入膽紅素的量，測(cè)定其含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。膽紅素平均回收率為102.78%，RSD=1.13%。表明準(zhǔn)確性較好。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

2.5樣品測(cè)定及限度制定按照擬定的色譜條件和方法，測(cè)定了17批次小兒珍貝散樣品中膽紅素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。小兒珍貝散中人工牛黃限度按照各批次結(jié)果的平均值下浮20%制定，限度為“每1克含人工牛黃以膽紅素（C33H36N4O6）計(jì)，不得少于0.45 mg”。

表3 小兒珍貝散樣品17批次含量測(cè)定結(jié)果/（mg/g）

3 討論

小兒珍貝散作為兒童用藥制劑，但相關(guān)的質(zhì)量研究甚少；處方中，川貝母、沉香、人工牛黃在投料中均有可能存在質(zhì)量隱患。故本研究通過(guò)對(duì)小兒珍貝散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和提高，希能真實(shí)反映產(chǎn)品質(zhì)量。

在顯微鑒別研究中發(fā)現(xiàn)，各廠家樣品均能檢出天竺黃的不規(guī)則透明片狀物，但該顯微特征均少見(jiàn)，最終建議刪除天竺黃的顯微特征方法，建立珍珠、川貝母、沉香的顯微特征鑒別方法，增加該品種的質(zhì)量控制指標(biāo)。

在沉香的薄層色譜方法研究中，因藥典標(biāo)準(zhǔn)中沉香薄層鑒別方法雖可行但斑點(diǎn)信息較少且主要為色酮類成分，故本次研究?jī)?yōu)化供試品處理方法，將溶劑乙醚換成乙酸乙酯，供試品斑點(diǎn)信息增多，同時(shí)增加香草醛硫酸溶液顯色，進(jìn)一步考察萜類成分。由圖2A圖譜信息顯示，沉香對(duì)照藥材有5個(gè)主斑點(diǎn)，供試品10-18與對(duì)照藥材斑點(diǎn)信息一致，供試品1～8缺失同一主斑點(diǎn)；由圖2B日光下圖譜信息顯示，在同一色譜條件下，前述缺失的主斑點(diǎn)處各樣品顏色深淺不一，1～8號(hào)斑點(diǎn)顏色整體淺于10～18號(hào)；說(shuō)明不同企業(yè)間沉香投料質(zhì)量存在一定差異。

在川貝母的薄層色譜方法研究中，參照藥典2015年版貝母屬類藥材甾體生物堿TLC鑒別的基礎(chǔ)上，比較超聲處理和加熱回流兩種處理方式，選擇加熱回流提取方式，同時(shí)調(diào)整和優(yōu)化展開(kāi)劑類型和比例，最終選擇環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（12∶10∶1）二次展開(kāi)系統(tǒng)。同時(shí)將川貝母與伊犁貝母、平貝母、湖北貝母及浙貝母等常見(jiàn)偽品進(jìn)行比較，從薄層色譜信息上可以看出川貝母對(duì)照藥材與川貝母斑點(diǎn)信息相似，斑點(diǎn)較少，且顏色較淺，與其他貝母信息斑點(diǎn)差距較大，伊犁貝母同時(shí)具有a、b、c、d 4個(gè)信息斑點(diǎn)，且顏色較深；企業(yè)A提供的川貝母藥材與該企業(yè)樣品10～12與伊犁貝母信息斑點(diǎn)相似，初步判定該企業(yè)投料存在質(zhì)量問(wèn)題。將圖譜導(dǎo)入ChemPaterrn軟件，對(duì)川貝母藥材（h）、伊犁貝母藥材（d）、企業(yè)A樣品（a、b、c）及企業(yè)B樣品（e、f、g）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果企業(yè)A樣品（a、b、c）與伊犁貝母聚成一類，進(jìn)一步說(shuō)明企業(yè)投料存在質(zhì)量問(wèn)題。

中國(guó)藥典2020年版人工牛黃含量測(cè)定膽紅素采用紫外分光光度法，該法干擾較大，專屬性較差，故本研究參照牛黃含量測(cè)定膽紅素含量測(cè)定方法。同時(shí)考察供試品超聲、回流兩種不同的處理方法，結(jié)果一致，從操作簡(jiǎn)捷的角度考慮，最終選擇了回流的供試品處理方法。含量測(cè)定結(jié)果顯示，各樣品之間含量差異較小，質(zhì)量較為穩(wěn)定。