NanoLuc的發(fā)展及其在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

張志恒，劉建喜

·綜述·

NanoLuc的發(fā)展及其在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

張志恒，劉建喜

生物發(fā)光是生物產(chǎn)生光的一種自然現(xiàn)象。當(dāng)小分子螢光素被螢光素酶催化氧化，形成發(fā)光激發(fā)態(tài)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)生物發(fā)光的現(xiàn)象。不同的螢光素-螢光素酶具有不同的發(fā)光波長，因此適用于不同的需求。在過去十年左右的時(shí)間里，蛋白質(zhì)工程、合成化學(xué)和物理學(xué)取得了巨大的進(jìn)步，使得螢光素和螢光素酶的應(yīng)用得到不斷拓展。生物發(fā)光反應(yīng)現(xiàn)在廣泛用于基因分析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的檢測、藥物發(fā)現(xiàn)中的高通量篩選（HTS）、衛(wèi)生控制、生態(tài)環(huán)境污染分析和小型哺乳動(dòng)物的活體成像等。

螢光素酶和相應(yīng)的底物已被開發(fā)并應(yīng)用了十余年，如螢火蟲螢光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)Luc）等。NanoLuc 螢光素酶（NLuc）作為最新商業(yè)化的螢光素酶[1]已被用于生物醫(yī)學(xué)研究，包括研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、研究遺傳調(diào)控和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、監(jiān)測蛋白質(zhì)表達(dá)的穩(wěn)定性、基于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）原理的傳感器和分子成像。NLuc 螢光素酶具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，但與傳統(tǒng)螢光素酶系統(tǒng)一樣也有其局限性。本文將介紹螢光素酶的種類，重點(diǎn)討論 NLuc 在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。

1 螢光素酶的種類

1.1 螢火蟲螢光素酶

1985 年，Kricka 和Leach[2]報(bào)道了在大腸桿菌中克隆螢火蟲螢光素酶，其底物是 D-螢光素，F(xiàn)Luc 與其底物的反應(yīng)式如圖1A 所示。與其他螢光素-螢光素酶系統(tǒng)相比，其優(yōu)勢在于 D-螢光素在氧化前需要被 ATP 激活，它對自動(dòng)氧化的敏感性更低，在溶液中更穩(wěn)定，背景化學(xué)發(fā)光更少。FLuc 作為報(bào)告基因的特點(diǎn)是其分子量為 62 kD，蛋白表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)光顏色為黃綠色，半衰期為 3 h，其他特點(diǎn)如表1 所示。

圖1 螢光素酶催化其底物的反應(yīng)式（A：FLuc 催化其底物的反應(yīng)式；B：RLuc 和 GLuc 催化其底物的反應(yīng)式；C：CLuc 催化其底物的反應(yīng)式；D：NLuc 催化其底物的反應(yīng)式）

表1 螢光素酶的種類與特點(diǎn)

名稱底物穩(wěn)定性可否互補(bǔ)靈敏度多色檢測參考文獻(xiàn) 螢火蟲螢光素酶（firefly luciferase）D-螢光素（D-Luciferin）（C11H8N2O3S2）++可互補(bǔ)+可用于多色檢測[3] 海腎螢光素酶（renilla luciferase）腔腸素（Coelenterazine）（C26H21N3O3）++可互補(bǔ)++可用于多色檢測[4-5] 高斯螢光素酶（gaussia luciferase）腔腸素（Coelenterazine）（C26H21N3O3）++可互補(bǔ)+++可用于多色檢測[6] 海螢螢光素酶（cypridina luciferase）海螢螢光素（Cypridina luciferin）+ +++可用于多色檢測[7] NanoLucFurimazine（C24H19N3O2）+++可互補(bǔ)++++可用于多色檢測[1, 8]

由于 D-螢光素-FLuc 系統(tǒng)產(chǎn)生 ATP 依賴的光輸出，該方法已被廣泛應(yīng)用于各種系統(tǒng)中 < 100 nm 的 ATP 濃度的測量，通常用于確定細(xì)菌污染的程度[9]。它還用于監(jiān)測 ATP 形成反應(yīng)和 ATP 降解反應(yīng)[10]。隨著更靈敏的光度計(jì)的出現(xiàn)和分析技術(shù)的改進(jìn)，現(xiàn)在可以使用市售的 ATP 生物發(fā)光試劑和試劑盒常規(guī)檢測低至阿托摩爾水平的 ATP（對應(yīng)于單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞）。D-螢光素具有最高的量子產(chǎn)率（41.0 ± 7.4）%，而大多數(shù)螢光素-螢光素酶對的量子產(chǎn)率僅為 15% ～ 30%；FLuc 系統(tǒng)具有最長的發(fā)射波長（λmax= 558 nm），更適合于血液的成像應(yīng)用[11]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞和生物實(shí)體，如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒，可以用合適的螢光素酶基因進(jìn)行基因編碼[12]，并導(dǎo)入小型哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行增殖、跟蹤和成像。

D-螢光素的細(xì)胞通透性并不是很好，因此在活體實(shí)驗(yàn)中必須大量使用[13]。使用14C標(biāo)記的放射性 D-螢光素底物的研究也表明底物在嚙齒動(dòng)物中的分布不均勻[14]。此外，在一些器官，如大腦，對探針的攝取很差[15]。D-螢光素與不同的輔助劑突變體相互作用能發(fā)出不同波長的光，發(fā)射波長的范圍不適合活體多參數(shù)成像，特別是在深層組織成像，因?yàn)楂@得的 D-螢光素和 FLuc 突變體的紅移最大為620 nm[16]，這個(gè)波長的光在組織中會(huì)被吸收、衰減和散射，使得不同螢光素酶的光譜分離更具挑戰(zhàn)性[17]。

1.2 海腎螢光素酶

在 20 世紀(jì) 70 年代，Matthews 等[18]從海參中純化了海腎螢光素酶（renilla luciferase，RLuc），其底物是腔腸素。RLuc（34 kD）分子量小于 FLuc，這使得它更適合于小載體和蛋白質(zhì)的應(yīng)用。RLuc 的蛋白表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)光顏色為藍(lán)色，半衰期為 5 h（表1）。與 FLuc 相比，RLuc 的量子產(chǎn)率較低，而且酶效率也較低[18]。

為了鑒定 HSP90/CDC37 PPI 的抑制劑，Siddiqui 等[19]建立了一種基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中等通量篩選方法，將海腎螢光素酶分為了兩個(gè)亞基，再把人類 HSP90 和 CDC37 與海腎螢光素酶的 N 端和 C 端片段融合而構(gòu)成一個(gè)篩選系統(tǒng)。螢光素酶的生物發(fā)光傳感器在分子生物學(xué)和成像系統(tǒng)中有著廣泛的應(yīng)用。Mokhtar-Ahmadabadi 等[20]使用循環(huán)置換策略設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種用于檢測和測量caspase-9 活性的基于海腎螢光素酶的生物傳感器。Dou 等[21]使用 mKATE-RLuc評估了在勃起功能障礙動(dòng)物模型中追蹤植入的人胎盤基質(zhì)細(xì)胞的功效。

腔腸素是比 D-螢光素更大的分子，水溶性差，由于不需要以腺苷酸化的形式激活，因此也容易發(fā)生自氧化，導(dǎo)致溶液中的化學(xué)發(fā)光較多。此外，腔腸素還可以通過其他機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。例如，多藥耐藥性 P-糖蛋白（MDR1 Pgp）介導(dǎo)腔腸素轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞系中，導(dǎo)致更多的腔腸素被轉(zhuǎn)運(yùn)到表達(dá)更多 MDR1 Pgp 的癌細(xì)胞中。從而導(dǎo)致腫瘤在小型哺乳動(dòng)物體內(nèi)成像不準(zhǔn)確，即無法檢測到不表達(dá) MDR1 Pgp 的腫瘤[22]。

1.3 高斯螢光素酶

高斯螢光素酶（Gaussia luciferase，GLuc）是一種分泌型的藍(lán)色螢光素酶，其底物是腔腸素，GLuc 與底物的催化反應(yīng)式如圖1B。該螢光素酶最初是從海洋橈足類動(dòng)物中提取的[23]。其蛋白分子量更小，只有22 kD，含有天然的分泌型信號(hào)肽，可以引導(dǎo)螢光素酶分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，從而無需裂解細(xì)胞即可檢測報(bào)告基因活性，并可用于活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)分析。而體內(nèi)試驗(yàn)也不需要處死動(dòng)物，直接取微量的動(dòng)物血液或尿液，就能用于定量檢測腫瘤細(xì)胞生長增殖情況及抗癌藥物藥效評價(jià)[24]。GLuc 沒有細(xì)胞毒性[24]，當(dāng)作為報(bào)告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，對細(xì)胞實(shí)驗(yàn)沒有影響。它的半衰期比較短，在體內(nèi)只有 20 min，螢光性質(zhì)穩(wěn)定，含有 GLuc 的細(xì)胞培養(yǎng)基在 4 ℃可以保存6 d，而在–80 ℃可以保存幾個(gè)月。

在監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展情況和腫瘤模型藥物治療評價(jià)方面，Chung 等[25]應(yīng)用 GLuc 進(jìn)行了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移及其他器官的研究。Shresthai 等[26]應(yīng)用 GLuc 聯(lián)合感光試劑原卟啉 IX 治療小鼠黑色素瘤。在高通量藥物篩選方面，Capul 和 de la Torre[27]應(yīng)用 GLuc 開發(fā)高通量篩選平臺(tái)篩選抗沙粒病毒芽孢的候選抑制劑，但其熒光信號(hào)衰減較快，影響信號(hào)采集。在其他應(yīng)用方面，Wille 等[28]用 GLuc 作為報(bào)告基因，用蛋白互補(bǔ)分析法研究沙門菌中 SipA 與 InvB 的相互作用。Suzuki 等[29]將表達(dá) GLuc 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)分子內(nèi)的二硫鍵是 GLuc 沿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌到胞外的必需結(jié)構(gòu)。

1.4 海螢螢光素酶

大約 80% 的發(fā)光生物生活在海洋中[30]，也被稱為海螢火蟲，是最簡單的海洋生物之一，身長只有 2 ～ 3 mm[31]。海螢螢光素酶（cypridina luciferase，CLuc）是從中提取的，它也是一種分泌型螢光素酶，呈藍(lán)紫色，蛋白分子量大小有 62 kD。同 GLuc 一樣，大部分螢光素酶產(chǎn)物會(huì)分泌到胞外，可對活細(xì)胞實(shí)施連續(xù)檢測，非常方便。由于信號(hào)很強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)殘留的螢光素酶還足以進(jìn)行常規(guī)的裂解細(xì)胞檢測，可實(shí)現(xiàn)多重檢測。

如圖1C 所示，該反應(yīng)只需要分子氧、海螢螢光素酶和海螢螢光素，隨著反應(yīng)的進(jìn)行可發(fā)出最大發(fā)射波長為 465 nm 的生物發(fā)光[31]。與其他生物發(fā)光反應(yīng)不同，該系統(tǒng)不需要任何輔因子，從而簡化了其在生物分析和生物成像中的使用。該系統(tǒng)另一個(gè)值得注意的特點(diǎn)是它的量子產(chǎn)率為 28%[32]。由于這些特點(diǎn)，海螢螢光素酶在酶免疫分析[33]、成像[34]、雙光子熒光探針、免疫組織學(xué)[35]、能量轉(zhuǎn)移分析[36]和作為基因報(bào)告[37]等方面是一個(gè)不可或缺的工具。

1.5 NLuc 螢光素酶

NLuc 是螢光素酶系統(tǒng)家族的最新成員。該螢光素酶來源于深海蝦，經(jīng)過三輪誘變優(yōu)化酶的發(fā)光輸出而獲得[1]。NLuc 比 FLuc 或 RLuc 的發(fā)光量高兩個(gè)數(shù)量級，在難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中也能獲得較好的結(jié)果。NLuc 簡單易用，且信號(hào)穩(wěn)定，可以不經(jīng)任何改良，實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)臺(tái)操作到高通量篩選的規(guī)模放大應(yīng)用。使用 Nano-Glo 螢光素酶檢測試劑，發(fā)光量在跨越 1 000 000 倍的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，且信號(hào)半衰期≥ 2 h。

NLuc 使用的底物為 Furimazine，是一種新型的底物，其反應(yīng)機(jī)制如圖1D 所示。它發(fā)光更亮，比現(xiàn)有的生物發(fā)光酶用途更加廣泛，是目前性能最好的生物發(fā)光報(bào)告基因之一。它具有無可比擬的小巧體積，可以用于增強(qiáng)病毒傳遞和蛋白融合。

2 NLuc 螢光素酶在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

NLuc 系統(tǒng)憑借靈敏度高、穩(wěn)定性高、體積小等優(yōu)勢，使得這一獨(dú)特技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，特別是在藥物研發(fā)的領(lǐng)域。

2.1 基于螢光素酶的傳感器

Griss 等[38]開發(fā)的基于螢光素酶的藥物指示劑（LUCID），是半合成的生物發(fā)光傳感器蛋白，由三個(gè)部分組成，分別是目標(biāo)藥物的受體蛋白、螢光素酶（NLuc）和自標(biāo)記蛋白，如 SNAP-Tag。另一個(gè)合成分子由 BRET 螢光團(tuán)和受體蛋白的配基組成，蛋白質(zhì)與配體結(jié)合，導(dǎo)致 NLuc 與螢光團(tuán)緊密結(jié)合，并由于 BRET 而紅移發(fā)射。在藥物分子存在的情況下，這種相互作用會(huì)受到干擾，因此測量藍(lán)光/紅光的比率就可以得到藥物濃度的測量結(jié)果。后來針對靶向藥物，還用抗體取代了生物傳感器中的結(jié)合蛋白質(zhì)[39]。研究表明，LUCID 既能檢測小分子藥物，也能檢測較大的肽類和大環(huán)類藥物濃度。它可以幫助醫(yī)生評價(jià)療效或確定給藥方案，使得給藥方案更加個(gè)體化。

2.2 基因檢測

NLuc最常見的應(yīng)用之一是用作報(bào)告基因，用于研究原核和真核細(xì)胞和系統(tǒng)中的基因表達(dá)[40]。這種分析可用于確定SARS-CoV-2 冠狀病毒和在蝙蝠中發(fā)現(xiàn)的RaTG13 冠狀病毒的感染[41]。冠狀病毒中刺突糖蛋白與人類細(xì)胞中的細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2（ACE2）結(jié)合被認(rèn)為是病毒進(jìn)入人類宿主細(xì)胞的關(guān)鍵[42]。將包含 FLuc 基因和目標(biāo)冠狀病毒株的刺突蛋白基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并孵育 72 h。收集這段時(shí)間后形成的假病毒，這些假病毒的表面具有所需的刺突蛋白，并在其內(nèi)部具有編碼 FLuc 的遺傳物質(zhì)。然后將這些假病毒與表達(dá) ACE2 的人類細(xì)胞孵育 60 h。如果病毒能夠成功感染人類細(xì)胞，就會(huì)產(chǎn)生子病毒和 FLuc，用于跟蹤病毒感染過程和候選藥物對病毒的作用。

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

裂解螢光素酶分析也被廣泛地用于檢測和評價(jià)蛋白質(zhì)間的相互作用（PPI）[43]。螢光素酶被分成兩個(gè)部分，其中一個(gè)部分由 N 端結(jié)構(gòu)域組成，另一個(gè)由 C 端結(jié)構(gòu)域組成。這兩部分分別被標(biāo)記到兩個(gè)目標(biāo)的蛋白質(zhì)上。若兩個(gè)蛋白之間有相互作用，螢光素酶的兩個(gè)末端變得非常接近，因此重建了螢光素酶報(bào)告功能。

基于 BRET 的分析已經(jīng)很好地研究了各種目標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，例如基于腫瘤學(xué)的靶標(biāo)，包括p53/hDM2 以及體外和纖維素中的 G 偶聯(lián)蛋白受體[44]。最近，使用 NanoBRET 技術(shù)成功檢測到其他 PPI 的抑制劑或穩(wěn)定劑，包括病毒 HCV NS5A 蛋白的定位和構(gòu)象、PRAS40 和 Hippo 通路之間的相互作用分析[45]、細(xì)胞中 CD26-ADA-A2AR 三聚體復(fù)合物的分析、使用 miniG 蛋白作為 GPCR 的探針[46]以及分析 H2 松弛素蛋白和 RXFP1 蛋白之間的相互作用[47]。隨著發(fā)出紅光的 BRET 受體的發(fā)展，NanoBRET 技術(shù)也被用于測量乳腺癌小鼠模型體內(nèi)的蛋白質(zhì)-配體相互作用，以確定靶點(diǎn)[48]。NLuc在這一方面的應(yīng)用可以幫助研究者確定藥物靶點(diǎn)并進(jìn)行潛在抑制劑的篩選。

2.4 活體成像

螢光素酶在分子水平上的生物發(fā)光成像所提供的靈敏度和特異性使其特別適用于小型哺乳動(dòng)物的活體成像[49]。

為了進(jìn)行活體生物發(fā)光成像，要對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使其包含產(chǎn)生螢光素酶的基因。這些細(xì)胞被注射到小型哺乳動(dòng)物的體內(nèi)，當(dāng)加入相應(yīng)的螢光素時(shí)，就可以進(jìn)行追蹤。這樣可以實(shí)時(shí)監(jiān)測體內(nèi)過程，而不需要犧牲動(dòng)物。但是在對某些目標(biāo)的成像上還具有一定的挑戰(zhàn)性，例如在活體動(dòng)物的大腦中對新的紅移和明亮的螢光素-螢光素酶對進(jìn)行成像。此外，還可用于感染性疾病的體外和活體發(fā)展成像[50]?；蛐揎椀纳锇l(fā)光病原體，如細(xì)菌、寄生蟲、病毒和真菌，可在體內(nèi)和體外進(jìn)行監(jiān)測，生物發(fā)光光輸出已被證明與感染負(fù)荷相關(guān)。螢光素酶在該方面的應(yīng)用使得成像變得更加方便。

2.5 在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)測中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)聚集已被發(fā)現(xiàn)是導(dǎo)致某些人類疾病的關(guān)鍵因素，如亨廷頓病和阿爾茨海默病。雖然蛋白質(zhì)聚集的作用已經(jīng)有了很詳細(xì)的文獻(xiàn)記載，但在體外和體內(nèi)研究蛋白質(zhì)聚集的方法有限。

考慮到這些限制，Zhao 等[51]將 NLuc 系統(tǒng)分成兩個(gè)部分監(jiān)測活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)聚集。一部分 NLuc（N65）與已知聚集的蛋白質(zhì)融合，而另一部分 NLuc 用于測量蛋白質(zhì)聚集水平。如果蛋白質(zhì)-NLuc 融合聚集，則第二部分NLuc的加入不會(huì)導(dǎo)致底物的生物發(fā)光；反之，在加入 Furimazine 時(shí)產(chǎn)生生物發(fā)光信號(hào)。NLuc 的兩個(gè)片段在體外進(jìn)行了鑒定，以確保這兩個(gè)片段（N65 和 66C）都是產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)所必需的。最后，將 NLuc 系統(tǒng)從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞上，表明只有當(dāng) NIH-3T3 細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染兩個(gè) NLuc 片段時(shí)才能觀察到發(fā)光，進(jìn)一步驗(yàn)證了 NLuc 可用于監(jiān)測體外蛋白質(zhì)聚集。NLuc在體外和體內(nèi)研究蛋白質(zhì)聚集方面提供了新的方向。

2.6 高通量篩選

基于生物發(fā)光的分析方法通常用于藥物發(fā)現(xiàn)，特別是針對細(xì)菌、病毒或寄生蟲等傳染性病原體的篩選。這是因?yàn)樵诨罴?xì)胞測定中，高通量篩選的優(yōu)點(diǎn)在于可以選擇分析規(guī)模，如96 孔或384 孔板，以及快速、靈敏和直接的光輸出讀數(shù)。將目標(biāo)基因、蛋白質(zhì)、酶或病原體與螢光素酶基因一起進(jìn)行基因編碼，根據(jù)樣品在加入底物時(shí)的光輸出，可以確定螢光素酶的表達(dá)，同時(shí)也反映了病原體的復(fù)制情況。

用于高通量篩選的標(biāo)簽和報(bào)告基因必須滿足所需的靈敏度、速度和經(jīng)濟(jì)性，迄今為止，沒有標(biāo)簽或報(bào)告基因能同時(shí)滿足所有的參數(shù)?；?NLuc 新的優(yōu)勢，Boute 等[52]檢測了 NLuc 是否適用于高通量篩選，首先構(gòu)建了幾個(gè)載體，可以克隆單鏈抗體 C 末端的 NLuc 或完整 IgG 分子的重鏈。將多克隆產(chǎn)物亞克隆到新的 NLuc 融合載體后，通過 scFv 文庫篩選對新的報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行應(yīng)用和檢驗(yàn)，對敏感性和對高通量篩選的適應(yīng)性進(jìn)行了評估。此外，NLuc 還展示了它在均質(zhì)分析設(shè)置、競爭 ELISA 和 Western blot 中的多功能性。

Alport 綜合征是一種遺傳性腎小球疾病，由 IV 型膠原 a3-a5 鏈（a3-a5(IV)）突變引起，如破壞三聚化，會(huì)導(dǎo)致腎小球基底膜變性。而糾正 A3/A4/A5 鏈的三聚化是一種可行的治療方法，但由于缺乏關(guān)于細(xì)胞內(nèi) a(IV) 鏈調(diào)節(jié)的信息，以及缺乏高通量篩選（HTS）平臺(tái)來評估 A345(IV) 三聚體的形成，導(dǎo)致在開發(fā)可行的治療方面沒那么順利。Omachi 等[53]開發(fā)了一組分裂的 NLuc 融合 A345(IV) 蛋白來監(jiān)測野生型和臨床相關(guān)突變株 A5(IV) 的 A345(IV) 三聚化。篩選確定了幾個(gè)有可能促進(jìn) A345(IV) 三聚體形成的化學(xué)伴侶。這種基于分裂 NLuc 的三聚體形成試驗(yàn)是一個(gè)功能性 HTS 平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了靶向 A345(IV) 三聚體治療 Alport 綜合征的可行性。

目前還沒有一種簡單、快速和定量的檢測方法，能夠?qū)@些分泌系統(tǒng)的生物學(xué)作用進(jìn)行分析以及針對這些系統(tǒng)的抑制劑進(jìn)行鑒定。Westerhausen 等[54]提出了一種通用的解決方案，利用小而非常明亮的 NLuc 來評估沙門氏菌致病島 1 編碼的 III 型分泌系統(tǒng)的功能。III 型分泌底物-NLuc 融合很容易分泌到培養(yǎng)上清中，去除細(xì)菌后通過發(fā)光法進(jìn)行定量?；?NLuc 的分泌物檢測具有非常高的信噪比和低至納升的靈敏度，該檢測方法適用于高通量評估分泌動(dòng)力學(xué)。

NLuc 在監(jiān)測細(xì)胞膜上受體內(nèi)化方面也有較為廣泛的應(yīng)用。2015 年，Liu 等[55]利用 NLuc 成功地監(jiān)測了 G 蛋白偶聯(lián)松弛素家族多肽受體（RXFP3）的內(nèi)化，獲得了一個(gè)穩(wěn)定的 HEK293T 細(xì)胞系，該細(xì)胞系共表達(dá) NLuc 標(biāo)記的RXFP3 和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的 RXFP3。EGFP 用于通過顯微鏡觀察受體內(nèi)化過程，NLuc 用于通過生物發(fā)光對測量結(jié)果進(jìn)行量化。若生物發(fā)光減少，則表明NLuc 標(biāo)記的 RXFP3 已被內(nèi)化到酸性溶酶體中。NLuc 除了能夠監(jiān)測 G 蛋白偶聯(lián)受體內(nèi)化，還可以用于發(fā)現(xiàn)該類受體的抑制劑或激動(dòng)劑。在一項(xiàng)類似的研究中，Wu 等[56]研究了人松弛素與 RXFP1 的相互作用，他們發(fā)現(xiàn) NLuc 結(jié)合的松弛素與 RXFP1 保持了高親和力（d= 1.11 ± 0.08 nmol/L）。因此，NLuc 在監(jiān)測 G 蛋白家族受體內(nèi)化方面以及在高通量篩選 G 蛋白家族的激動(dòng)劑和抑制劑方面起到了重要的作用。

除了以上的應(yīng)用，圖2 顯示了基于 NLuc 開發(fā)的不同的高通量篩選方法。其中圖2A 使用 NLuc 作為報(bào)告基因來檢測細(xì)胞膜上的受體內(nèi)化的情況[57]，圖2B 利用 NLuc 高通量篩選抗體[52]。圖2C 和 2D 是將 NLuc 分成 HiBiT 和 LgBiT 兩個(gè)亞基[58]，圖2E 和 2F 是將 NLuc 分成 SmBiT 和LgBiT 兩個(gè)亞基[59]。HiBiT 和 SmBiT 標(biāo)簽是一種僅由11 個(gè)氨基酸組成的肽標(biāo)簽，當(dāng)插入到目標(biāo)蛋白中時(shí)，通過與 LgBiT 形成二聚體而起到 NLuc 的作用[42, 58]。而兩者的區(qū)別是，HiBiT 與 LgBiT 之間的親和力比 SmBiT 與LgBiT 之間的親和力高[58]，前兩者能自發(fā)形成 NLuc 功能性復(fù)合物，而后兩者因?yàn)檩^低的親和力，不易自發(fā)形成完整的 NLuc。SmBiT 與 LgBiT 的結(jié)合需要借助外力，如圖2F 中，當(dāng)兩個(gè)蛋白相互作用時(shí)，兩個(gè) NLuc 亞基距離足夠近，此時(shí)才能互補(bǔ)形成完整的 NLuc[42]。

3 NLuc 螢光素酶在藥物研發(fā)應(yīng)用過程中的優(yōu)勢及局限

NLuc 憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢在藥物研發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用，然而與其他螢光素酶技術(shù)一樣，NLuc 也有局限性，這可能會(huì)導(dǎo)致它在分子生物學(xué)的某些領(lǐng)域受到限制。

3.1 優(yōu)勢

NLuc 平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)包括其增強(qiáng)的亮度、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和在細(xì)胞中的無偏分布。此外，與綠色熒光蛋白（GFP）等其他報(bào)告基因不同，NLuc 不需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行翻譯后修飾[60]。在這種條件下，報(bào)告基因可以低水平表達(dá)[61-62]。此外，NLuc 還改進(jìn)了以前的類似技術(shù)，NanoBiT 和NanoBRET 可以用于體外和活體可逆地檢測蛋白質(zhì)相互作用[63]。NanoBRET 避免了 Forster 共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）與熒光團(tuán)的問題，例如需要外部光源、供體熒光蛋白的光漂白、供體和受體分子的同時(shí)激發(fā)以及細(xì)胞或動(dòng)物模型中的自發(fā)熒光。絕大多數(shù) BRET 系統(tǒng)使用 NanoLuc/Furimazine 組合作為能量供體，因?yàn)樗?D-螢光素/FLuc 發(fā)光明顯更亮，信號(hào)更強(qiáng)，并且分子量比 FLuc 小得多，這使得將其標(biāo)記到目標(biāo)蛋白質(zhì)上不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。由于這些系統(tǒng)是可逆的，因此當(dāng)它們與競爭性抑制劑孵育時(shí)，也可以用來監(jiān)測相互作用的蛋白質(zhì)的位移。在活體成像中使用熒光探針存在光漂白和背景自發(fā)光，放射性示蹤劑保質(zhì)期很短等問題，需要同步加速器才能生產(chǎn)，而生物發(fā)光探針不存在這些缺點(diǎn)。螢光素酶催化底物產(chǎn)生光，因此背景極低，信號(hào)/背景比極高。采用熒光測量的方法必須處理自發(fā)熒光背景的問題，使用紅移染料必須要有良好的組織滲透性，而使用螢光素酶進(jìn)行活體成像能避免這些問題。NLuc 平臺(tái)與其他螢光素酶系統(tǒng)的多路復(fù)用能力，允許雙螢光素酶分析，光譜發(fā)射曲線充分分離，以獲得更大的動(dòng)態(tài)范圍和更高的靈敏度。

圖2 NLuc 螢光素酶在高通量篩選中的應(yīng)用[A：利用 NLuc 螢光素酶作為報(bào)告基因用于細(xì)胞膜受體內(nèi)化的測定；B：利用 NLuc 螢光素酶高通量抗體篩選；C：利用 NLuc 螢光素酶（HiBiT + LgBiT）篩選 GPCR 的激動(dòng)劑和抑制劑；D：利用 NLuc 螢光素酶（HiBiT + LgBiT）篩選調(diào)節(jié) PD-L1 表達(dá)的化合物；E：利用 NLuc 螢光素酶（SmBiT + LgBiT）篩選 SARS-CoV-2 主蛋白酶的抑制劑；F：利用 NLuc 螢光素酶（SmBiT + LgBiT）篩選 SARS-CoV-2 RBD 和人 ACE2 相互作用的抑制劑]

3.2 局限性及解決方案

NLuc 在藥物篩選應(yīng)用過程中的第一個(gè)局限是它的發(fā)射波長。NLuc 的最大發(fā)射波長為 460 nm，相對于RLuc 和 GLuc 分別藍(lán)移了約 20 nm 和 25 nm，這對于活體研究來說并不是最理想的。第二個(gè)潛在局限是其底物 Furimazine 僅針對 NLuc，且不易獲得。因此，NLuc 平臺(tái)的成本高于傳統(tǒng)的螢光素酶系統(tǒng)，這可能會(huì)限制其在實(shí)驗(yàn)室的可及性。另外還有一個(gè)局限在于在高通量篩選中，使用螢光素酶作為報(bào)告基因可能導(dǎo)致某些化合物在抑制試驗(yàn)中出現(xiàn)假陽性或假陰性。FLuc、RLuc 和NLuc 都可以被各種小分子抑制，例如，F(xiàn)Luc 尤其受到與其底物 D-螢光素具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物的競爭抑制，這些化合物包括苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噁二唑和聯(lián)芳基噁二唑。還有些化合物可能是結(jié)合在目標(biāo)蛋白上從而影響了螢光素酶的構(gòu)象，導(dǎo)致螢光素酶的活性發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。此外，一些化合物還可能導(dǎo)致報(bào)告酶轉(zhuǎn)錄或翻譯增加，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果[64]。

對于第一個(gè)局限，由于 NLuc 不是活體成像的最佳候選者，但是利用 NLuc 的 BRET 能力可以有效地克服這一限制。對于第二個(gè)局限成本問題，隨著該系統(tǒng)變得成熟，并在科學(xué)界得到更廣泛的應(yīng)用，成本問題也將不再是其局限了。第三點(diǎn)，為了克服 NLuc 在高通量篩選中出現(xiàn)的假陽性的不足，可以采用平行藥物篩選靶點(diǎn)。通過兩個(gè)甚至多個(gè)藥物靶點(diǎn)的篩選相互作對照，比對同一個(gè)化合物對于不同藥物靶點(diǎn)的作用，把共同的陽性小分子藥物挑選出來，這可能就是 NLuc 的抑制劑。對該化合物進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)，用非螢光素酶的方法來排除假陽性的結(jié)果，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

還可以通過建立一個(gè)能夠在給定篩選數(shù)據(jù)集中識(shí)別假陽性分子的化學(xué)信息學(xué)模型，來剔除藥物篩選中出現(xiàn)的可能是假陽性的結(jié)果。Ghosh 等[65]探索了在基于螢光素酶的 HTS 檢測中篩選和檢測螢光素酶抑制劑的各種方法，如分子對接、SMARTS 篩選、藥效團(tuán)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法等。了解抑制劑是如何與螢光素酶結(jié)合的，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，以更好地了解此類抑制劑的化學(xué)性質(zhì)。在基于結(jié)構(gòu)的方法中，顯示出良好的結(jié)果，模型準(zhǔn)確率為 74.2%。然而，使用關(guān)聯(lián)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法的表現(xiàn)優(yōu)于其他探索的方法，模型的準(zhǔn)確率為 89.7%。該模型的高預(yù)測準(zhǔn)確度有望用于鑒別哪些化合物是高通量篩選中潛在的螢光素酶抑制劑。在這項(xiàng)工作中開發(fā)的模型可以在 ochem 平臺(tái)（http://ochem.eu）免費(fèi)獲得。

4 小結(jié)

隨著時(shí)間的推移，生物發(fā)光機(jī)制的研究和各式發(fā)光生物的開發(fā)都取得了驚人的進(jìn)展。早期發(fā)現(xiàn)并開發(fā)的螢光素酶如FLuc、RLuc、GLuc 等在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的使用，最新商業(yè)化的 NLuc 在臨床前和臨床階段具有廣闊的前景。

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226019 南通大學(xué)特種醫(yī)學(xué)研究院

劉建喜，Email：liujianxi01@yahoo.com

2021-11-15