南海礁棲海藻共附生真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41 403 次級代謝產物研究

葉禹秀, 羅小衛(wèi), 楊斌, 林秀萍, 劉永宏, 周雪峰

1. 廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院, 廣西 南寧 530200;

2. 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 廣東省海洋藥物重點實驗室, 中國科學院南海海洋研究所, 廣東 廣州510301;

3. 海南省熱帶海洋生物技術重點實驗室, 三亞中科海洋研究院, 海南 三亞 572024

為適應復雜的海洋生態(tài)環(huán)境, 海藻共附生微生物可產生獨特的次生代謝產物參與宿主的防御體系,幫助宿主抵抗外界致病菌和病毒的侵害, 以及其他海洋生物的攻擊。這些獨特的次生代謝產物往往骨架新穎、活性顯著, 為新型海洋藥物的研發(fā)提供寶貴資源(楊曦亮 等, 2020)。擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)作為一類分布較為廣泛的內生真菌,其產生的次級代謝產物具有結構新穎性、生物活性豐富的特點, 很多具有較強的抗腫瘤、抗真菌、抗病毒活性(陳霈雯 等, 2019; 馬麗麗 等, 2021)。對陸地植物和沿海紅樹植物共附生來源擬盤多毛孢屬真菌的代謝產物研究相對較多, 如冼嘉韻 等(2017)從南海紅樹林植物桐花樹來源的內生雜色擬盤多毛孢屬真菌中分離得到具有良好抗腫瘤活性化合物pestalachlorides C 和抗炎活性的 pestalachlorides B。對海洋動植物來源的該屬真菌代謝產物研究相對較少。本課題組前期從南海永興島海域采集的礁棲腔節(jié)藻屬海藻(Coelarthrumsp.)中分離得到一株擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403,已經從中分離鑒定6 個具有較弱細胞毒性的天然產物, 2 個具有較明顯的COX-2 抑制活性的二苯酮衍生物和1 個可作為肝臟X 受體α 調節(jié)劑的天然產物(Wang et al, 2020a, b; Liang et al, 2021)。然而, 該礁棲海藻共附生真菌代謝產物非常豐富, 仍有不少代謝產物尚未分離鑒定。因此, 本研究在HPLC 導向下對重新發(fā)酵的該菌株提取物進行化學成分研究,定向分離純化該菌株中尚未鑒定的代謝產物, 以期發(fā)現更多結構新穎或活性顯著的天然產物, 為海藻來源擬盤多毛孢屬真菌的藥用活性成分挖掘提供重要依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超導核磁共振儀(瑞士Bruker 公司AVANCE-500 MHz); 質譜儀(Waters 公司XEVO TQD); 高效液相色譜儀(日本島津公司LC10AVP); 中壓制備色譜(瑞士步琪 LC3000); 旋轉蒸發(fā)儀(東京理化N-1100D-WD); 電子天平(德國塞多利斯股份公司BS110S); 數控超聲波清洗器(鞏義市予華儀器有限公司KQ-250DB); 三層多功能搖床(北京博宇寶威實驗設備有限公司HYG-CXI 型); 自動蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療器械有限公司LX-B100L 型); 半制備色譜柱: YMC-Pack, ODS-A, 250×10mm,S-5μM ,12nm(YMC 公司); 薄層層析硅膠GF-254 和柱層析硅膠 200-300 目(煙臺江友硅膠有限公司);HPLC 色譜純試劑: 甲醇、乙腈(瑞典Oceanpark 公司); 實驗分析純試劑: 石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等(天津大茂化學試劑廠)。

1.2 菌種來源

菌株分離自采集于南海永興島附近海域珊瑚礁的腔節(jié)藻屬海藻(Coelarthrumsp.), 鑒定為擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403(Wang et al, 2020a)。海藻和真菌菌株分別由中國科學院南海海洋研究所連喜平博士和林秀萍博士鑒定, 菌種樣本保存在中國科學院南海海洋研究所海洋微生物研究中心(編號SCSIO41403)。

1.3 提取分離

菌株發(fā)酵過程見前期報道的方法(Wang et al,2020a)。獲得的乙酸乙酯浸膏采用中壓色譜柱進行分離, 用 100～200 目硅膠拌樣, 經中壓制備色譜分離(石油醚:CH2Cl2100:0～1:1)梯度洗脫后得到41 個餾分(Fr.1～Fr.41)。在高效液相分析導向下,定向分離之前尚未發(fā)現的代謝產物。Fr.4 經半制備高效液相(CH3CN:H2O 90:10)分離純化得到化合物 1(3.9mg), Fr.26 經半制備高效液相(CH3CN:H2O 34:66) 分離純化得到化合物2(13.5mg)、化合物 5(5.9mg)和化合物 6(3.5mg);Fr.7 經半制備高效液相(CH3CN:H2O 90:10)分離純化得到化合物 3(10.7mg); Fr.24 經半制備高效液相(CH3CN:H2O 70:30)純化得到化合物4(9.1mg)?；衔?～6 結構如圖1 所示。

1.4 抗菌活性實驗

供抗菌活性篩選的菌株為白色念珠菌(Candida albicansATCC 10231)。采用K-B 法(Kirby-Bauer test)測定分離得到的6 個化合物對白色念珠菌的抑制活性(譚才鄧 等, 2016)。

供試菌的準備: 將白色念珠菌菌種接種到LB瓊脂培養(yǎng)基上活化24～48h, 然后接種于30mL LB 液體培養(yǎng)基中, 置于恒溫震蕩搖床中(28 ℃,180r·min-1), 培養(yǎng)24h。

試驗平板的準備: 先往已冷卻至 50℃左右的LB 半固體培養(yǎng)基中注入3mL 菌液, 混合均勻, 傾注平板約30mL, 靜置待用。

抗菌活性測定: 將無菌干燥的空白濾紙片(直徑 6mm)分別用移液槍滴加藥物原液和對照溶液,每張濾紙片含待測待測化合物分別為5μg, 陰性對照為甲醇, 陽性對照為制霉菌素(nystatin)。將各含藥紙片貼加于試驗平板, 37℃恒溫培養(yǎng)18～24h, 測定其紙片周圍抑菌圈直徑的大小。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物3: 白色粉末, 10.7mg, 分子式C11H12O4;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 5.20 (2H, s, H-2),3.76 (3H, s, 5-OMe), 2.19 (3H, s, 6-Me), 2.14 (3H, s,4-Me);13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 173.2 (C,C-1), 163.9 (C, C-5), 153.9 (C, C-7), 143.6 (C, C-3),118.6 (C, C-6), 116.7 (C, C-4), 106.2 (C, C-8), 70.2(CH2, C-2), 60.4 (O-CH3, 5-OMe), 11.5 (CH3, 4-Me),8.7 (CH3, 6-Me)。以上數據與文獻報道基本一致, 故鑒 定 該 化 合 物 為 7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalidc (Jia et al, 2015)。

化合物4: 白色粉末, 9.1mg, 分子式C10H12O3;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 6.70 (1H, q,J=6.5 Hz, H-2’), 5.89 (1H, s, H-5), 5.44 (1H, s, H-3),3.80 (3H, s, 4-OMe), 1.82 (3H, d,J= 7.0 Hz, 2′-Me)1.80 (3H, s,1′-Me);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 171.6 (C, C-4), 164.5 (C, C-2), 161.4 (C, C-6),130.4 (CH, C-2′), 126.7 (C, C-1′), 97.3 (CH, C-5),88.1 (CH, C-3), 56.0 (CH3, 4-OMe), 14.4 (CH3,2′-Me), 12.2 (CH3, 1′-Me)。以上數據與文獻報道基本一致, 故鑒定該化合物為pestalotiopyrones G (張宏岐 等, 2018)。

化合物5: 黃色粉末, 5.9mg, 分子式C7H6O2;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 9.88 (1H, s, H-7),7.82 (2H, dd,J= 8.1,1.0 Hz, H-2,6), 6.96 (2H, dd,J=8.1,1.0 Hz, H-3,5);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 191.1 (CH, C-7), 161.3 (C, C-4), 132.5 (CH,C-2), 132.5 (CH, C-6), 130.2 (C,C-1), 116.1 (CH, C-3),116.1 (CH, C-5)。以上數據與文獻基本一致, 故鑒定該化合物為 4-hydroxybenzaldehyde (田倩倩 等,2010)。

化合物 6: 淡黃色粉末, 5.9 mg, 分子式C10H12O3;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 7.27(1H, s, 4-OH), 7.09 (2H, dd,J= 8.0,1.0 Hz, H-2,6),6.77 (2H, dd,J= 8.0,1.0 Hz, H-3,5), 4.24 (2H, t,J=6.8 Hz, H-8), 2.87 (2H, t,J= 6.8 Hz, H-7), 2.05 (3H, s,H-10);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 171.3 (C,C-9), 154.3 (C, C-4), 130.1 (CH, C-2), 130.1 (CH,C-6), 120.5(C, C-1),115.4 (CH, C-3), 115.4 (CH, C-5),65.3 (CH2, C-8), 34.2 (CH2, C-7), 21.1 (CH3, C-10)。以上數據與文獻基本一致, 故鑒定該化合物為4-羥基苯乙基乙酸酯 (韋瑋 等, 2018)。

2.2 抗菌活性

通過觀察試驗平板發(fā)現化合物3(1mg·mL-1)對白色念珠菌有明顯抑制活性, 其抑菌圈直徑為25mm, 其他化合物無明顯活性。陽性藥 nystatin(25mg·mL-1)抑菌圈直徑為30mm。

3 討論

本文對腔節(jié)藻海藻來源擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403 的次級代謝產物進行了分離鑒定, 共分離出6 個單體化合物, 為首次從該菌株發(fā)現, 其中化合物1、2、5 和6 是首次從海洋動植物(不含紅樹植物)共附生微生物中發(fā)現。根據文獻報道, 化合物6 對子宮頸癌細胞有顯著抑制活性(關永強 等, 2014)?；衔? 對Cox-B3和RSV 有明顯的抗病毒活性, 其IC50分別為39.0和78.0μmol·L-1(Jia et al, 2015)。本研究首次發(fā)現化合物3 對白色念珠菌有明顯抑制活性。

根據文獻報道, 海藻共附生真菌代謝產物的生物活性主要集中在抗菌和抗腫瘤領域, 其次為抗氧化、抗炎等其他活性。這些活性天然產物的產生與特殊的生存環(huán)境及宿主的生長調節(jié)、化學防御等生命活動密切相關(楊曦亮 等, 2020)。海藻共附生真菌活性次級代謝產物研究雖已取得一定進展, 但其具體的代謝意義和特殊性, 以及與藻類宿主的微妙關系仍有待深入探究。對于擬盤多毛孢屬真菌, 文獻中陸地植物和沿海紅樹植物來源的代謝產物研究相對較多, 而對海洋來源比如海藻共附生來源的, 其代謝產物和活性化合物研究相對較少。本研究為海藻共附生擬盤多毛孢屬真菌的代謝產物研究及其藥用活性挖掘提供了參考。