正交試驗優(yōu)選鎮(zhèn)眩方提取純化工藝

黃秋狄，孫繼秋，萬細(xì)嵐，謝家翠，黃 佩，周 毅

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 511435；2.江西省吉安市吉水縣白水鎮(zhèn)衛(wèi)生院，吉安 331617；3.江西省撫州市東鄉(xiāng)區(qū)疾控中心，撫州 331800）

眩暈是一種運(yùn)動性的神經(jīng)錯覺，是一類多發(fā)、常見的癥狀表現(xiàn)。患者發(fā)病時感到頭暈，同時伴有惡心嘔吐、視物旋轉(zhuǎn)等癥狀，具有明顯的主觀不適感[1]。李妍怡[2]從血瘀、痰濁、虛證3個方面論治由恣食肥甘、勞倦太過引起的痰眩取得了滿意的療效。鎮(zhèn)眩方由甘草、白芍、桂枝、川芎等藥材組成，具有養(yǎng)血利水、重鎮(zhèn)止眩的功效，對耳源性眩暈、眼源性眩暈和椎底動脈供血不足引起的眩暈，均有較好的療效[3]。有研究[4]用鎮(zhèn)眩湯治療90例眩暈癥，治愈49例，顯效58例，有效38例，無效5例，總有效率為96.7%；服藥時間最短15 d，最多62 d，平均28 d，未見副作用。

鎮(zhèn)眩方原為煎煮湯劑，但湯劑存在煎煮過程繁瑣、不易攜帶、口感不好等缺點(diǎn)。為解決這些問題，本課題擬對鎮(zhèn)眩方進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。在前期超臨界CO2萃取桂枝、川芎等藥材的基礎(chǔ)上[5]，對處方其余藥材和超臨界萃取殘渣進(jìn)行了提取純化研究，以其提取物浸膏得率和具有消炎鎮(zhèn)靜作用的芍藥苷[6]、甘草苷[7]的含量為指標(biāo)，采取正交試驗設(shè)計優(yōu)選鎮(zhèn)眩顆粒的最佳水提和醇沉工藝，為后續(xù)鎮(zhèn)眩方的進(jìn)一步研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

UC25-12TPA型超聲波清洗機(jī)（寧波市雙嘉儀器有限公司）；星爍牌C型玻璃儀器氣流烘干器（廣州市星爍儀器有限公司）；HH，SII-NI6B型電熱恒溫水浴鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）；ME104型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；HZT-A500型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；超臨界CO2萃取裝置（環(huán)球分析測試儀器有限公司）；高效液相色譜儀（島津有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甘草苷對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司）、芍藥苷對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司）、甘草（甘肅寶芝林農(nóng)業(yè)科技有限公司）、白芍（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司）、熟地黃（鄭州瑞龍制藥股份有限公司）、茯苓（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司）。標(biāo)準(zhǔn)品純度為97%以上；乙腈為色譜純，其余溶劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草苷和芍藥苷含量測定

2.1.1 色譜條件 Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈-水（20∶80）為流動相；檢測波長為230 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為40℃；進(jìn)樣量20μL。理論板數(shù)按甘草苷、芍藥苷峰計算，應(yīng)不低于2 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定甘草苷、芍藥苷對照品0.230 mg，置10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取藥材適當(dāng)粉碎，合并超臨界萃取藥渣，加入9倍量的水，回流提取1 h，2次。濃縮提取液至一定濃度，加入乙醇，醇沉濃度50%，醇沉24 h，過濾，濃縮至干浸膏。置于50 mL容量瓶中，蒸餾水定容，超聲30 min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 按處方比例（不含甘草、白芍）稱取藥材適量，按“2.1.3”項下方法制成陰性對照品溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗和專屬性實驗 分別精密吸取甘草苷和芍藥苷對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果表明甘草苷保留時間為10.50 min，芍藥苷保留時間為7.50 min，甘草苷、芍藥苷與供試品其他組分分離度良好（R>1.5），陰性對照品無干擾，見圖1。

圖1 鎮(zhèn)眩方中芍藥苷、甘草苷HPLC譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液不同體積置于10 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容，制成濃度梯度分布的系列溶液，搖勻，在“2.1.1”項色譜條件下記錄峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），對照品濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘草苷回歸方程：y=15 269x-8 489.7，R2=0.999 9，表明甘草苷在2.00～100.00μg.mL-1呈良好的線性關(guān)系；得到芍藥苷回歸方程為y=33 545x-31 494，R2=0.999 9，表明芍藥苷在4.08～204.00 g·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度考察 取“2.1.2”項對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次精密吸取20μL，記錄甘草苷、芍藥苷的峰面積，并計算RSD值。結(jié)果表明，甘草苷RSD值為1.19%（n=6），芍藥苷RSD值為0.66%（n=6），精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，甘草苷面積的RSD為1.87%（n＝6），芍藥苷面積的RSD為0.46%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批水提醇沉浸膏6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算甘草苷、芍藥苷含量。結(jié)果，甘草苷的RSD值為2.34%（n=6），芍藥苷的RSD值為2.91%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收試驗 精密吸取供試品溶液2 mL，分別精密加入混合對照品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果，甘草苷的平均回收率及RSD分別為89.15%、1.09%，芍藥苷的平均回收率及RSD分別為101.52%、3.47%。

2.1.11 樣品的測定 精密稱取正交試驗浸膏樣品適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算甘草苷和芍藥苷含量。每批樣品平行測定3次，取平均值作為測定結(jié)果。

2.2 正交試驗優(yōu)化水提工藝

2.2.1 水提工藝設(shè)計[8-9]選定液料比、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以甘草苷提取率、芍藥苷提取率和出膏率為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗設(shè)計，因素水平見表1。

表1 水提工藝正交因素水平表

2.2.2 正交試驗結(jié)果及分析 甘草苷和芍藥苷是鎮(zhèn)眩方中的活性成分，將其權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.35，此外由于浸膏得率也是考察提取工藝的一個重要指標(biāo)，故將其權(quán)重系數(shù)也設(shè)為0.35。

由正交試驗直觀分析可知（表2），以綜合評分為考察指標(biāo)時，各因素對水提效果的影響依次為C（提取次數(shù)）＞A（液料比）＞B（提取時間），各因素水平影響為A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C3＞C2＞C1。通過方差分析表（表3）進(jìn)一步分析，液料比、提取時間和提取次數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。綜合評分表明最佳水提工藝為A3B2C3，但是考慮該工藝提取能耗較高，且A3和A2，C3和C2間的水提效果差異不明顯，綜合考慮，選取最優(yōu)水提工藝為A2B2C2，即9倍量的水，提取2次，每次1.5 h。

表2 水提工藝正交試驗結(jié)果

表3 水提工藝綜合評分方差分析

2.2.3 驗證試驗 按照處方比例，稱取藥材80 g（40 g為超臨界萃取殘渣），加9倍量的水煎煮兩次，每次1.5 h，合并濾液濃縮至黏稠狀態(tài)，105℃干燥5 h，稱重，進(jìn)行三次重復(fù)實驗。測得平均浸膏得率為41.46%，平均芍藥苷提取率為63.15%，平均甘草苷提取率為58.96%，與正交試驗相比較，結(jié)果表明驗證實驗結(jié)果各指標(biāo)成分均達(dá)到較高水平，該提取工藝穩(wěn)定、合理、可行，見表4。

表4 水提工藝正交試驗驗證結(jié)果

2.3 正交試驗優(yōu)化醇沉工藝

2.3.1 醇沉工藝設(shè)計[10-11]選定浸膏密度、醇沉濃度、醇沉?xí)r間為考察因素，以甘草苷轉(zhuǎn)移率、芍藥苷轉(zhuǎn)移率和出膏率為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗設(shè)計，見表5。

2.3.2 正交試驗結(jié)果及分析 由正交試驗直觀分析可知，以綜合評分為考察指標(biāo)時，各因素對醇沉效果的影響依次為B（醇沉濃度）＞A（浸膏密度）＞C（醇沉?xí)r間），各因素水平影響為A2＞A3＞A1，B3＞B1＞B2，C3＞C2＞C1。方差分析結(jié)果顯示，浸膏密度、醇沉濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，醇沉?xí)r間對醇沉效果差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。綜合考慮，選取最優(yōu)醇沉工藝為A2B3C1，即浸膏密度為1.04～1.08 g·mL-1，醇沉濃度為90%，醇沉?xí)r間為24 h，見表6、7。

表6 醇沉工藝正交試驗結(jié)果

2.3.3 驗證試驗 按照1/3處方比例，稱取藥材，加9倍量的水煎煮兩次，每次1.5 h，合并濾液濃縮至密度1.04～1.08 g·mL-1，加入乙醇量90%，靜置24 h。過濾濃縮至黏稠狀，105℃干燥5 h，稱重，進(jìn)行三次重復(fù)實驗。測得平均浸膏得率為13.66%，平均芍藥苷轉(zhuǎn)移率為78.71%，平均甘草苷轉(zhuǎn)移率為71.10%，與正交試驗相比，驗證實驗結(jié)果的各指標(biāo)成分均達(dá)到較高水平，表明該提取工藝穩(wěn)定、合理、可行，見表8。

表7 醇沉工藝綜合評分方差分析

表8 醇沉工藝正交試驗驗證結(jié)果（%）

3 討論

鎮(zhèn)眩湯以湯劑的形式用于臨床多年，獲得了良好療效[4]?，F(xiàn)代中藥研究表明，組成該方的十味（其中兩味為龍骨和牡蠣）中藥多含有大量的水溶性多糖和苷類成分，比如地黃中的寡糖、當(dāng)歸中的當(dāng)歸多糖、白術(shù)中的白術(shù)多糖、茯苓中的茯苓多糖等，都具有造血、提高免疫、鎮(zhèn)痛及調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動等功能，因此初步確定使用水提取更為方便。除此之外，現(xiàn)代藥理研究還發(fā)現(xiàn)該方中藥中所含的小極性成分，比如地黃中的環(huán)烯醚萜苷，當(dāng)歸中的蒿苯內(nèi)酯、5-羥甲基糠醛（降血壓效果是由5-羥甲基糠醛、鞣酸、腺苷和?；撬岬冉M分共同作用的結(jié)果），白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯等都具有較強(qiáng)的活性，其中川芎中的川芎嗪有較顯著的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用。因此可結(jié)合使用超臨界萃取技術(shù)有效地提取這些小極性物質(zhì)。本次研究在超臨界萃取的基礎(chǔ)上將甘草、白芍、熟地黃、茯苓協(xié)同超臨界萃取殘渣采用水提、醇沉的方式，盡可能多的提取有效成分，保證藥效，同時也盡可能保證其與臨床作為湯劑使用時的相同功效。

本研究在宏觀上采用浸膏得率控制，微觀方面以甘草苷和芍藥苷含量作為考察指標(biāo)，分別賦予0.35的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行綜合評分，優(yōu)選提取工藝主要考慮三者在其中的重要性。鎮(zhèn)眩方中起作用的成分很多，甘草苷、芍藥苷分別是甘草和白芍的主要活性成分，而且甘草苷[12-13]和芍藥苷[14]還對引起眩暈的疾病具有一定的療效。另外，將極性相近的芍藥苷、甘草苷在同一個條件的HPLC色譜中跑出，不但能很好地監(jiān)測提取純化的效果，同時也節(jié)約了操作過程中的成本。

醇沉法利用有效成分能溶于乙醇而雜質(zhì)不溶于乙醇的特性，在加入乙醇后，有效成分溶于乙醇而雜質(zhì)則被沉淀出來，醇沉的目的是除去雜質(zhì)保留藥物有效成分。盡管目前已經(jīng)有許多純化的方法，但因醇沉的優(yōu)勢，其在藥企仍然占有很重要的地位[15]。中藥材中多糖、淀粉等含量相對較高，也容易被水提提取出來，使提取的浸膏黏稠度大、體積多，且這些雜質(zhì)容易造成制劑不穩(wěn)定、不易保存，使溶液易產(chǎn)生沉淀，所以后續(xù)進(jìn)行了醇沉除雜工藝的研究。研究結(jié)果表明，通過正交試驗選取的水提、醇沉工藝重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，但還需要結(jié)合藥理藥效的數(shù)據(jù)進(jìn)一步確定最終工藝，相關(guān)研究將在下一步完成。