PI3K/A kt/mTOR信號通路相關蛋白在日光性角化病和鱗狀細胞癌中的表達

劉昱昕，曹 雪，董靈娣，喻 楠

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚科，銀川 750004）

日光性角化?。╝ctinic keratosis，AK）是一種由表皮內發(fā)育不良細胞組成的病變，臨床表現(xiàn)為長期受陽光照射皮膚上出現(xiàn)斑疹、斑塊[1-2]。研究顯示，2008年美國AK患病率有14%[3]，意大利30～40歲人群AK患病率為27.4%[4]，中國AK的患病率為0.52%[5]。該病為一種癌前病變，據統(tǒng)計約65%未經治療的AK可進展為鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）[6]。SCC是全球第六大常見的惡性腫瘤，每年有超過55萬新發(fā)病例[7]，其為侵襲性惡性腫瘤，易沿淋巴道轉移[8]，嚴重危害患者的身心健康。多發(fā)性AK患者每年發(fā)生皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）的風險從0.15%到80%不等，而超過60%的SCC繼發(fā)于AK[9]。因此，如果沒有進行早期干預治療，部分患者最終可能發(fā)展為SCC。

目前，越來越多的觀點認為，AK、SCC為一個連續(xù)的疾病譜[10-11]。AK轉變?yōu)镾CC過程中有多種信號通路參與，如TGF-β/Smad信號通路，而有研究進一步發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smad信號傳導通路與PI3K/Akt信號傳導通路之間存在相互作用關系[12]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR是一條經典促腫瘤發(fā)生的信號傳導通路，在紫外線誘導cSCC形成中發(fā)揮重要作用[10]，但關于皮膚腫瘤中該通路的研究較少。因此，本研究將其與正常皮膚組織進行對比分析，探討PI3K/Akt/mTOR信號通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白在AK及cSCC組織中的表達，為AK及cSCC的發(fā)病提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 組織標本

本研究選取2019年12月至2021年5月就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院經皮膚鏡及組織病理學確診為AK（AK組）和cSCC的患者（cSCC組）各30例，并選取同時期就診本醫(yī)院的17例行植皮手術的正常人皮膚組織作為正常對照（NS）組。寧夏醫(yī)科大學倫理委員會審核同意開展本課題相關科學研究工作（倫理審查編號：2020-382），參加研究的所有患者及其家屬均知情同意。

1.2 納入與排除標準

納入標準：皮膚鏡初篩符合AK及cSCC診斷，并經組織病理HE檢查確診者。排除標準：有腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病者；有心臟疾病、高血壓病、糖尿病等基礎疾病者；合并其他皮膚腫瘤及皮膚疾病者；臨床資料不完整者；有家族遺傳病及病理檢查診斷不典型者。

1.3 儀器及試劑

mTOR抗兔單克隆抗體（Cell Signaling，7C10）；Akt抗兔單克隆抗體（Cell Signaling，11E7）；PI3K抗兔單克隆抗體（Abcam，ab191606）；免疫組化試劑盒、凱基生物全蛋白提取試劑盒、凱基生物顯影液試劑盒均購自偉博鑫生物科技有限公司。所用儀器：電泳儀（美國BIO-RAD公司）、凝膠圖像分析系統(tǒng)Imager 600（美國Amersham公司）、組織病理脫水機（德國Leica公司）、石蠟切片機（德國Leica公司）。

1.3.1 免疫組化染色法 石蠟包埋，將各組皮膚組織分別制作成3～5μm厚的病理切片，撈片后60℃烘箱烘烤過夜，分別在二甲苯及梯度乙醇中浸泡4～10 min脫蠟水化后，蒸餾水浸泡1 min，后置于EDTA修復液中用水浴鍋水浴2～3 min，于片上分別滴加一抗PI3K（濃度1∶200）、Akt（濃度1∶400）、mTOR（濃度1∶200）三種抗體室溫3 h孵育。山羊抗兔免疫球蛋白作為二抗室溫孵育30 min，以DAB作為顯色劑，蘇木精復染、封片、鏡檢，Image pro plus軟件檢測陽性細胞數量，每組數值用Excel表格統(tǒng)計，并進行統(tǒng)計分析制圖。

1.3.2 蛋白免疫印跡（Western blot）法 分別在-80℃低溫冰箱取NS組、AK組、cSCC組皮膚組織，放入研磨珠勻漿儀勻漿后，加入蛋白裂解液提取皮膚組織細胞總蛋白。用10%SDS-PAGE凝膠將蛋白進行電泳分離70 min，濕法轉印至PVDF膜上，后用5%牛奶室溫封閉90 min，選擇目標條帶分別加入一抗Akt（濃度1∶1 000）、PI3K（濃度1∶1 000）、mTOR（濃度1∶1 000），4℃孵育過夜，次日復溫30 min后，二抗室溫孵育1.5 h，加顯影液后放入化學發(fā)光分析儀中分析條帶結果，Image J軟件掃描獲取灰度值，進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

所測數據均經Excel表格統(tǒng)計標記整合，使用Graph-pad Prism 9軟件進行統(tǒng)計分析并繪圖。計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

AK組30例，其中男性13例（43%），女性17例（57%），年齡范圍39～88歲，平均年齡（63.17±11.61）歲；cSCC組30例，其中男性14例（47%），女性16例（53%），年齡范圍52～82歲，平均年齡（67.73±8.85）歲；NS組17例，其中男性7例（41%），女性10例（59%），年齡范圍31～78歲，平均年齡（60.4±6.73）歲。

2.2 HE染色結果

AK組病理表現(xiàn)為角質層萎縮、肥厚，不典型角質形成細胞在角質層聚集，皮膚表皮層可見較多大小不一異形不典型細胞聚集。cSCC組病理表現(xiàn)為癌細胞突破表皮浸潤至真皮層，可見角化珠，局部無正常皮膚結構，可見較多炎性細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組患者臨床皮膚外觀及組織病理學HE染色

2.3 免疫組化結果

PI3K/Akt/mTOR信號通路中，PI3K蛋白在NS組呈極低陽性表達，在AK基底層未突破基底膜帶，細胞質及間隙呈陽性表達，在cSCC中表現(xiàn)為突破基底層，細胞質及間隙呈陽性表達；Akt蛋白在NS組呈極低陽性表達，在AK表皮層細胞質及間隙呈陽性表達，在cSCC中表現(xiàn)為突破基底層在細胞間隙及細胞質呈陽性表達；mTOR蛋白在NS組呈低陽性表達，在AK表皮層，細胞質及間隙呈陽性表達，在cSCC突破基底膜帶至細胞全層，細胞質及間隙呈陽性表達，見圖2。PI3K、Akt、mTOR蛋白在NS組、AK組、cSCC組中陽性細胞量呈逐漸遞增趨勢（P均＜0.05），見圖3。

圖2 PI3K、Akt、mTOR蛋白免疫組化檢測結果

圖3 PI3K、Akt、mTOR免疫組化統(tǒng)計結果

2.4 Western blot檢測結果

cSCC組中PI3K、mTOR、Akt蛋白表達水平均高于AK組、NS組（P均＜0.05）。AK組PI3K、mTOR的蛋白表達水平均高于NS組（P均＜0.05），見圖4。

圖4 PI3K、Akt、mTOR蛋白條帶結果及條帶灰度值量化統(tǒng)計結果

3 討論

AK是常發(fā)于中老年人的慢性皮膚病，被認為是cSCC癌前病變，男性發(fā)病率較高，多見于面部、手背等暴露部位[13]。cSCC是來源于一種角質形成細胞的慢性皮膚惡性腫瘤，與紫外線照射、人乳頭瘤病毒、化學致癌物、熱損傷等有密切關系[14]。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，AK是SCC的癌前病變，從正常皮膚到AK再到SCC即紫外線至皮膚癌的疾病譜。

PI3K/Akt/mTOR是一條經典的促存活和抗凋亡的信號轉導通路。該通路的上游關鍵信號分子PI3K在受到多種生長因子、細胞因子刺激時，可被異?；罨?，進而激活其下游底物Akt，引起Akt磷酸化，進一步激活其下游底物mTOR[16]。PI3K/Akt/mTOR信號通路被發(fā)現(xiàn)在眾多腫瘤細胞中異常激活，如生殖系統(tǒng)腫瘤[17]、消化系統(tǒng)腫瘤[18]。該通路在超過80%的SCC中存在頻繁過度激活，是頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）中突變頻率最高的有絲分裂相關通路，為HNSCC臨床治療提供了極具潛力的關鍵分子靶點[19]。該信號通路激活會導致幾乎所有的頭面部SCC發(fā)生，并且該通路會調控及影響SCC患者的復發(fā)及其后期的不良預后[20]。另有研究[21]發(fā)現(xiàn)，紫外線作用表皮生長因子受體（EGFR）引起PI3K/Akt/mTOR信號通路過度激活，激活程度：SCC＞AK＞正常皮膚。提示PI3K/Akt/mTOR信號通路同樣參與AK的發(fā)生和發(fā)展，AK和SCC均可能通過該通路發(fā)生轉化，但目前相關報道較少。

本實驗免疫組化檢測提示，相較于正常皮膚，PI3K、Akt、mTOR在癌前病變AK中，定位在范圍局限的表皮基底細胞質中，而該通路三個關鍵蛋白在cSCC中，其陽性表達位于突破基底膜的真皮深層，說明PI3K/Akt/mTOR通路上三個關鍵蛋白參與誘發(fā)AK及cSCC。且從正常皮膚、AK及cSCC經免疫組化定量統(tǒng)計顯示陽性表達率呈遞增變化，符合PI3K/Akt/mTOR信號通路激活程度SCC＞AK＞正常皮膚的研究；進一步通過蛋白免疫印跡法對上述蛋白進行定量研究，也發(fā)現(xiàn)PI3K、Akt、mTOR在NS、AK、cSCC組織中的蛋白表達水平呈依次遞增趨勢，結果及變化趨勢與免疫組化法相同，提示PI3K/Akt/mTOR通路與AK、cSCC關系密切，可能參與了二者的發(fā)生及轉變。為后續(xù)進一步研究AK及cSCC的發(fā)病機制提供了理論依據。本研究也存在一定的局限性，如僅觀察了PI3K/Akt/mTOR通路中關鍵蛋白的表達變化，未能進一步研究該通路的功能及具體作用機制。