肥胖2型糖尿病導(dǎo)致小鼠睪丸生精功能障礙的研究

蘇亞珊，王強(qiáng)強(qiáng)，王春紅，李 健，孫亞群，李廣永，吳 際，何 瑞

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

不孕不育是21世紀(jì)僅次于腫瘤和心血管疾病的第3位疾病，在全球范圍內(nèi)，有10%～15%的育齡期夫婦受不孕不育困擾，其中男性因素約占50%[1]。男性不育發(fā)生的主要機(jī)制是精子發(fā)生障礙。精子發(fā)生障礙在臨床上主要表現(xiàn)為無精子癥、少精子癥、畸形精子癥和（或）弱精子癥。少弱精癥是指精子數(shù)量減少，活力降低，精子形態(tài)和功能異常，除先天遺傳因素外，吸煙、飲酒、肥胖癥、代謝性疾病、心理壓力、環(huán)境或職業(yè)暴露等外在原因都是造成男性不育的潛在危險(xiǎn)因素[2]。據(jù)報(bào)道[3]，90%以上的糖尿病患者伴隨生殖功能紊亂，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）增加與精液質(zhì)量、濃度以及運(yùn)動性的下降相關(guān)。且母親受孕時(shí)父親的健康可以通過表觀遺傳修飾的跨代傳播來影響后代的代謝健康和生殖潛力[4]。因此，肥胖及肥胖2型糖尿病對男性生殖功能有重要影響，不僅會導(dǎo)致男性生育能力降低，也會損害子代的健康，但其機(jī)制尚不明確。本文通過高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠，探尋肥胖2型糖尿病引起的小鼠睪丸生精功能損傷及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電泳儀、免疫印記實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)膜儀（韋克斯（北京）有限公司）、Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）、凝膠成像系儀（美國Bio-Rad公司）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、熒光倒置顯微鏡（德國Bresser公司）、高速臺式離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、高脂飼料（45%fat，D12451；美國Research Diets公司）、普通飼料、BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

16只4周齡15～20 g的SPF級雄性C57BL/6J小鼠，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學(xué)SPF級屏障環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施IVC系統(tǒng)，自然光源，濕度30%～40%，溫度（25±2）℃，噪聲水平保持在85 dB以下，所有小鼠自由飲水，自由飲食。所有涉及的動物實(shí)驗(yàn)及程序均獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（No.10752309202100057），所有操作均根據(jù)國家研究委員會的實(shí)驗(yàn)室動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，16只C57BL/6J小鼠按照體質(zhì)量梯度抽樣法分為對照組（n=8）和實(shí)驗(yàn)組（n=8）：對照組小鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飲食16周，實(shí)驗(yàn)組小鼠飼喂高脂飲食16周。造模開始前，測量所有小鼠的初始體質(zhì)量和空腹血糖，造模完成后再次測量，以確認(rèn)造模成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本處理 飲食誘導(dǎo)期間，每3 d記錄兩組小鼠的體質(zhì)量和攝食量。不同飲食誘導(dǎo)16周后，所有小鼠均進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）和胰島素耐量試驗(yàn)（ITT），并對其曲線下面積進(jìn)行比較。造模結(jié)束后，兩組小鼠均在麻醉后進(jìn)行心臟采血，3 500 r·min-1，離心15 min后，取上清于-80℃保存。用手術(shù)剪剪開小鼠腹部，充分暴露雙側(cè)睪丸，除去周圍的脂肪組織及結(jié)締組織，取出睪丸、附睪以及精囊腺，吸干表面的血液后用電子天平準(zhǔn)確稱取重量，并計(jì)算其臟器系數(shù)。將左側(cè)睪丸放置于-80℃低溫保存進(jìn)行蛋白水平檢測，右側(cè)睪丸用4%多聚甲醛固定后進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.3.2 精子參數(shù)檢測 右側(cè)小鼠附睪尾切碎，搖勻，水浴5 min，使精子游離出來，用200目細(xì)胞篩過濾附睪組織，獲得精子懸液。取20μL精子懸液滴在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在400倍光鏡下計(jì)數(shù)精子數(shù)量，計(jì)算單位重量附睪尾精子數(shù)。根據(jù)附睪的重量，進(jìn)一步計(jì)算附睪的平均精子數(shù)。采用半定量方法評價(jià)精子活力，每個(gè)樣本取20μL精子懸液。在400倍光鏡下觀察約200個(gè)精子的游動狀態(tài)，計(jì)算精子活力的比例。在精子懸液中加入適量的Diff-Quick溶液，高倍鏡下觀察精子形態(tài)，記錄畸形精子數(shù)并計(jì)算畸形率。精子畸形大致可分為卷曲、大頭、雙頭、雙尾、無鉤、香蕉等形。有頭無尾、輪廓不清、重疊和明顯被剪碎的精子不計(jì)。精子畸形率（%）=畸形的精子數(shù)/檢查的精子數(shù)×100%。將大約20μL的伊紅-苯胺黑染液（1.67%尹紅，10%苯胺黑）和等體積的精子上清懸液混合，在室溫下孵育2 min，死精子被染成粉色，活精子不能著色，在400倍光鏡下觀察大約200個(gè)精子并計(jì)算精子活率。精子活率（%）=活精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。

根據(jù)第四版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》提供的正常精液參考值評定，少精子癥：一次射精的活精子濃度＜1×106/mL；少弱畸精子癥：精子濃度＜20×106/mL，同時(shí)a+b級運(yùn)動精子＜20%和／或精子形態(tài)異常率＞85%；弱畸精子癥：精子濃度＞20×106/mL，正常形態(tài)精子＜10%，同時(shí)a+b級運(yùn)動精子＜50%。

1.3.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 取小鼠睪丸組織100 mg，液氮研磨后加入RIPA裂解液+1%蛋白酶抑制劑+1%磷酸酶抑制劑，冷凍研磨機(jī)研磨5 min后，4℃、12 000 r·min-1，離心10 min，取上清；按照凱基生物BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒說明進(jìn)行蛋白定量。用PAGE凝膠快速制備試劑盒制備聚丙烯酰胺凝膠，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫下在脫脂奶粉中封閉1 h，用TBST洗膜，洗膜3次，每次10 min。將膜放在一抗稀釋液中，加入一抗，在4℃冰箱孵育過夜。次日復(fù)溫30 min后用TBST洗膜3次，每次10 min。將洗好的膜放入稀釋好的二抗中，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。用碧云天ECL發(fā)光試劑盒顯影，用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光顯像，用Image J軟件工具進(jìn)行灰度值分析，以β-actin（表1）為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白與β-actin的比值，可反映表達(dá)水平的變化。

表1 抗體名稱、種屬、來源、稀釋比例

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Prism 7.0（美國GraphPad公司）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對小鼠體質(zhì)量、血糖的影響

造模開始前，兩組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），給予不同飲食誘導(dǎo)16周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量重于對照組（P＜0.01）；口服葡萄糖耐量（OGTT）結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖值在給糖后第15、30、60、120 min均高于對照組（P均＜0.05），實(shí)驗(yàn)組小鼠OGTT曲線下面積（AUC）大于對照組（P＜0.01）；胰島素耐量試驗(yàn)（ITT）結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖值在腹腔注射胰島素后第15、30、60、120 min的血糖值均高于對照組（P均＜0.05），ITT的AUC均大于對照組（P均＜0.01），見圖1。

圖1 不同飲食誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量和血糖的變化

2.2 高脂飲食對小鼠生殖器官質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

用不同飲食喂養(yǎng)16周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠生殖器官睪丸、附睪、精囊腺的質(zhì)量均低于對照組小鼠，實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)和精囊腺系數(shù)均低于對照組小鼠（P均＜0.05），見表2。

表2 不同飲食誘導(dǎo)小鼠生殖器官質(zhì)量與系數(shù)的變化（±s）

表2 不同飲食誘導(dǎo)小鼠生殖器官質(zhì)量與系數(shù)的變化（±s）

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

分組對照組實(shí)驗(yàn)組n 8 8器官質(zhì)量/mg 器官系數(shù)睪丸 附睪 精囊腺 睪丸 附睪 精囊腺216.82±89.24 93.23±13.27 239.60±84.49 0.74±0.03 0.32±0.03 0.82±0.07 189.59±13.28** 82.51±8.05** 219.43±42.45** 0.46±0.04** 0.20±0.03** 0.54±0.08*

2.3 高脂飲食對小鼠精子參數(shù)的影響

用不同飲食誘導(dǎo)16周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠精子數(shù)量減少、精子活力降低（P均＜0.01），根據(jù)diff quik快速染色法，在高倍鏡下觀察精子形態(tài)，記錄卷曲、大頭、雙頭、雙尾、無鉤、香蕉形等畸形精子，實(shí)驗(yàn)組畸形精子增加（P均＜0.05），見圖2。

圖2 不同飲食誘導(dǎo)小鼠精子參數(shù)的變化

2.4 高脂飲食對小鼠睪丸生精小管病變的影響

對照組小鼠睪丸生精小管之間連接緊密，排列整齊。精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞以及精子均處于不同發(fā)育階段，呈放射狀排列，有5～8層，腔內(nèi)有致密的精子，間質(zhì)細(xì)胞排列整齊緊密；實(shí)驗(yàn)組小鼠生精小管明顯皺縮，生精上皮細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，排列紊亂，層次不清，生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，曲細(xì)小管間質(zhì)組織部分甚至全部缺失，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。精子數(shù)量明顯減少，見圖3。

圖3 不同飲食誘導(dǎo)小鼠睪丸形態(tài)學(xué)的變化

2.5 高脂飲食引起了睪丸組織的過度自噬

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸組織中LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1蛋白表達(dá)均增加（P均＜0.05），見圖4。

圖4 不同飲食誘導(dǎo)小鼠自噬的變化

3 討論

高脂飲食與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如糖尿病、高血壓、脂肪肝等[5]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，目前全球糖尿病患者超過1.5億，我國糖尿病患者數(shù)量居世界第2位，已超過4 000萬[6]。肥胖2型糖尿病是目前全球發(fā)病率最多也是最容易被忽視的公共衛(wèi)生問題之一[7]。

生殖系統(tǒng)損傷在肥胖糖尿病患者中發(fā)病率高達(dá)90%，是非糖尿病人群發(fā)病率的3倍以上，嚴(yán)重影響了患者的健康和壽命以及育齡夫婦的生育[8]。睪丸是糖尿病患者長期高血糖狀態(tài)下最敏感的器官之一，糖尿病患者長期處于高血糖環(huán)境，睪丸結(jié)構(gòu)及生精功能受到損害，從而導(dǎo)致少弱精子癥的發(fā)生，甚至造成不育。

本課題組通過對雄性C57BL/6J小鼠進(jìn)行高脂飲食誘導(dǎo)，探討肥胖2型糖尿病對睪丸生殖功能的損傷機(jī)制。C57BL/6J小鼠經(jīng)16周高脂飲食，造成體質(zhì)量增加和血糖異常，是代謝研究領(lǐng)域公認(rèn)且成熟的肥胖型2型糖尿病模型[9-10]?；诖四Ｐ停狙芯框?yàn)證高脂飲食在誘導(dǎo)肥胖2型糖尿病的同時(shí)，可造成雄性睪丸功能障礙，精子發(fā)生異常。高脂飲食16周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量增加，葡萄糖耐量異常，ITT顯示胰島素敏感性降低，提示實(shí)驗(yàn)組小鼠為肥胖伴有2型糖尿病。在此基礎(chǔ)上，本課題組檢測了小鼠精子參數(shù)，發(fā)現(xiàn)精子數(shù)量減少、活力降低，且出現(xiàn)少弱精癥。進(jìn)一步進(jìn)行睪丸形態(tài)學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸形態(tài)異常，生精細(xì)胞損傷。

睪丸是保證精子發(fā)生的場所，是精子發(fā)生的組織學(xué)基礎(chǔ)，睪丸一旦受損，就會導(dǎo)致精子產(chǎn)生相應(yīng)的功能改變[11]。超重或肥胖男性與BMI正常男性相比，精子活力和頂體反應(yīng)下降，同時(shí)精子DNA損傷指數(shù)增高，形成的胚胎碎片率高，質(zhì)量下降[12]。

Western blot結(jié)果顯示，自噬相關(guān)蛋白在高脂飲食組小鼠中的表達(dá)增加。自噬是一種分解代謝過程，起到了生存機(jī)制的雙重作用，適當(dāng)自噬可減少高脂飲食對睪丸造成的損傷，過度自噬會導(dǎo)致睪丸組織不可逆的損傷，引起生精細(xì)胞功能障礙。因此，高脂飲食導(dǎo)致的睪丸生精功能障礙，可能是因?yàn)楦咧嬍痴T導(dǎo)睪丸組織的過度自噬，從而引起生精細(xì)胞的過度自噬，造成生精功能紊亂。

綜上，高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖伴2型糖尿病，可導(dǎo)致睪丸精子發(fā)生障礙，其機(jī)制可能是高脂飲食誘發(fā)了睪丸組織的過度自噬，從而引起睪丸生精細(xì)胞數(shù)量及功能異常。