時(shí)序性老化中皮膚形態(tài)學(xué)的變化及MMP1、MMP12定量分析研究

王文成，張亞文，馬 瑞，張 偉，曹 池，李姝霖，田建英

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，銀川 750002）

皮膚老化程度是評(píng)估人的年齡的關(guān)鍵決定因素。皮膚老化是皮膚組織退化，表現(xiàn)為皮膚功能和結(jié)構(gòu)衰退，適應(yīng)性和防御能力下降，包括未出現(xiàn)明顯臨床病變的老年綜合征和衰弱[1]。此外，人的皮膚隨著年齡增加，失去彈性變得松弛而下垂[2-4]。皮膚老化與真皮中膠原纖維變性的時(shí)序性老化和光老化的累積有關(guān)[5]；這可能是年齡因素有關(guān)的皮膚老化。隨著醫(yī)療技術(shù)飛速發(fā)展，預(yù)防皮膚老化是當(dāng)今研究者的熱門話題[6]。近些年，皮膚老化治療效果取得了一定成效，但其治療效果維持時(shí)間較短。本研究探討不同年齡大鼠皮膚自然老化中的形態(tài)學(xué)變化規(guī)律及其機(jī)制。基質(zhì)金屬蛋白酶由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，主要降解膠原纖維和彈力纖維，其在皮膚老化過(guò)程中扮演著重要角色。通過(guò)皮膚含水量評(píng)估皮膚老化程度，揭示皮膚老化的可能機(jī)制，為預(yù)防皮膚老化、研發(fā)抗衰新藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，分青年組（4月齡，體質(zhì)量180～200 g）、中年組（10月齡，體質(zhì)量360～380 g）、老年組（24月齡，體質(zhì)量540～560 g），每組16只，年齡分組依據(jù)文獻(xiàn)[7-8]；剃干凈大鼠背部6 cm×10 cm區(qū)域毛發(fā)，觀察皮膚外觀，腹腔麻醉后，冰上每組取8只大鼠背部正中新鮮皮膚1 cm×2 cm，用于做皮膚含水量、生化指標(biāo)、ELISA、RT-PCR、電鏡等實(shí)驗(yàn)，其中電鏡數(shù)據(jù)分析參考文獻(xiàn)[9]。采用4%多聚甲醛灌注，取大鼠背部正中皮膚1 cm×2 cm固定于4%多聚甲醛中，用于觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)變化。SD大鼠/實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（寧）2020-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1 儀器 石蠟包埋機(jī)（型號(hào)：Histocore Arcadia H；徠卡顯微系統(tǒng)公司），全自動(dòng)石蠟切片機(jī)（型號(hào)：RM2265；徠卡顯微系統(tǒng)公司），組織攤片烤片機(jī)（型號(hào)：TKY-TKA；湖北泰康醫(yī)療設(shè)備公司），黏附載玻片及蓋玻片（型號(hào)：REF.188105；江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：南京牌；南京實(shí)驗(yàn)儀器廠），光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：BX51；奧林巴斯公司），透射電鏡（型號(hào)：H7650；徠卡顯微系統(tǒng)公司），電鏡切片機(jī)（型號(hào)：UC7；徠卡顯微系統(tǒng)公司），全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀（型號(hào)：JXFSTPRP-CL；上海凈信公司），酶標(biāo)儀（型號(hào)：Varioskan Lux；賽默飛世爾公司），高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Scientific；賽默飛世爾公司），均由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.2 試劑 石蠟（德國(guó)徠卡公司，貨號(hào)：1903142），維多利亞彈力纖維染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1596），亮綠SF染色液1%（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1270），羥脯氨酸（HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A030-2-1），MMP1、MMP12試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司，批號(hào)：ml1002968、ml1059520），BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物公司，批號(hào)：KGP902）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織染色及圖像分析[10-17]將組織石蠟塊垂直切片（vertical section），厚度3μm，用黏附載玻片分別撈取，放入65℃烘烤載玻片1 h，后放入4℃冰箱儲(chǔ)存。按照HE染色、Masson（亮綠）、維多利亞藍(lán)染色的實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行脫蠟、染色、中性樹脂封片，用奧林巴斯系統(tǒng)分別采集HE×40、HE×200、Masson染色和維多利亞藍(lán)染色×400倍鏡下圖片。圖片使用Image Pro Plus 6.0軟件按體視學(xué)原理分析垂直截面圖像，面積分?jǐn)?shù)=體積分?jǐn)?shù)，反映膠原纖維和彈力纖維在大鼠真皮層所占體積百分?jǐn)?shù)。每組10張組織切片，每張切片隨機(jī)測(cè)定10個(gè)值后取平均值。透射電鏡每個(gè)樣本采集10張，電鏡下觀察膠原原纖維變化、測(cè)量膠原原纖維直徑、橫紋周期、間距、密度等指標(biāo)。

1.3.2 皮膚含水量測(cè)定[18-19]取背部皮膚組織1 cm×1 cm，除去皮下脂肪組織，放入包埋盒中，用電子天平精確稱量皮膚濕重；80℃烘箱烘干24 h，精密稱量皮膚干重。根據(jù)以下公式計(jì)算皮膚水分含量：皮膚水分（%）=（皮膚濕重-皮膚干重）/皮膚濕重×100%。

1.3.3 堿水解法檢測(cè)皮膚HYP含量[20]電子天平精準(zhǔn)稱取每組皮膚組織濕重然后放入EP管中，加入水解液混勻，95℃水浴水解20 min，調(diào)pH值至6.0～6.8，離心10 min取上清做檢測(cè)。HYP含量（μg/mgprot）=（測(cè)定OD值-空白OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（5μg·mL-1）×水解液總體積（mL）/組織濕重（mg）。HYP是膠原組織重要的代謝指標(biāo)，測(cè)定膠原蛋白的含量一般用HYP的7.46倍換算，皮膚膠原蛋白含量=HYP含量×7.46。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)MMP1、MMP12含量[21-23]將大鼠皮膚組織稱重后，用剪刀剪碎組織放入研缽，倒入液氮將組織研磨至粉末狀，加入PBS液，磁珠分離法勻漿，離心后取上清，用BCA法分別測(cè)每組大鼠皮膚組織的蛋白濃度。按照上海酶聯(lián)試劑盒操作計(jì)算得出每組MMP1、MMP12的濃度，再除以每組皮膚組織蛋白濃度。

1.3.5 Real-time PCR測(cè)定SD大鼠皮膚組織中的MMP1、MMP12的表達(dá)[24-25]SD大鼠皮膚總RNA提取和cDNA合成，根據(jù)Trizol法提取SD大鼠皮膚RNA，分別測(cè)定獲取每組RNA濃度和其A260/A280值。取2μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為5℃1 h，99℃15 min，5℃5 min，獲取cDNA置于-80℃保存?zhèn)溆?。聚合酶鏈反?yīng)（PCR）擴(kuò)增MMP1、MMP12引物序列（表1），PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件為50℃2 min，95℃3 min，95℃20 s，58℃20 s，72℃20 s，39個(gè)循環(huán)。將所得CT值按照2-△△CT的方法處理數(shù)據(jù)。

表1 RT-PCR檢測(cè)引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 表皮與真皮觀察 光鏡下，青年組大鼠表皮突呈波浪狀，幅度小，角質(zhì)層薄，真皮膠原染色呈淺紅色，膠原束排布緊密，附屬器豐富；與青年組大鼠比較，中年大鼠表皮無(wú)明顯差異，表皮突波浪狀明顯，附屬器數(shù)量減少。老年大鼠表皮突顯著波浪狀，發(fā)生皺縮，附屬器數(shù)量減少；與中年組大鼠比較，老年組大鼠表皮突波浪幅度較大，發(fā)生皺縮，真皮萎縮變薄，附屬器數(shù)量減少，見(jiàn)圖1A、1B。

與青年組大鼠比較，中年組大鼠表皮厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但真皮厚度變薄（P＜0.05），老年組大鼠表皮、真皮厚度均變薄（P均＜0.05）。與中年組大鼠比較，老年組大鼠表皮、真皮厚度均變?。≒均＜0.05），見(jiàn)圖1C、1D。

圖1 不同年齡鼠表皮、真皮厚度變化

2.1.2 膠原纖維與彈力纖維觀察 光鏡下，青年組大鼠真皮膠原纖維較致密、呈波浪狀、整齊有序、分布均勻，膠原束走向與表皮平行，膠原束間間隙較小，彈力纖維呈細(xì)長(zhǎng)的分支狀，穿梭于膠原纖維間，真皮淺層、深層空間排列較規(guī)則；與青年組大鼠比較，中年組大鼠真皮膠原較疏松，膠原束空間排列欠規(guī)律，大部分與表皮走向平行，少數(shù)膠原纖維變性、均質(zhì)化、排布散亂，彈力纖維空間排列疏散，可見(jiàn)少數(shù)斷裂、纏結(jié)、粗化，大部分分布于真皮淺層，真皮深層彈力纖維散在分布顯著減少；老年組大鼠真皮膠原疏松顯著，膠原束空間排列紊亂，極少數(shù)膠原束走向與表皮平行，膠原束間間隙顯著增大，大多膠原束斷裂，膠原纖維變性、均質(zhì)化顯著，大部分彈力纖維斷裂、纏結(jié)、粗化，特別是真皮深層幾乎未見(jiàn)彈力纖維穿梭于膠原纖維間，空間排布紊亂。與中年組大鼠比較，真皮膠原疏松，膠原束空間排列較紊亂，膠原束走向與表皮平行，膠原束間間隙增大，膠原束斷裂，膠原纖維變性、均質(zhì)化顯著，彈力纖維斷裂、纏結(jié)、粗化，特別是真皮深層幾乎未見(jiàn)彈力纖維穿梭于膠原纖維間，空間排列紊亂，見(jiàn)圖2A、2B。

與青年組大鼠比較，中年組大鼠膠原纖維含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但彈力纖維含量減少（P＜0.01）；老年組大鼠膠原纖維含量、彈力纖維含量均減少（P均＜0.01）。與中年組大鼠比較，老年組大鼠膠原纖維含量、彈力纖維含量均減少（P均＜0.01），見(jiàn)圖2C、2D。

圖2 不同年齡鼠真皮膠原纖維、彈力纖維變化

2.1.3 超微結(jié)構(gòu)觀察 大鼠真皮透射電鏡下觀察，數(shù)百根膠原原纖維組成膠原束。青年組大鼠橫斷面膠原束排列緊密，膠原束間距小，排列整齊，束內(nèi)膠原原纖維排列均勻有序，粗細(xì)均一，平均直徑94.8 nm，膠原原纖維間距平均為17.2 nm，平方納米單位面積下膠原原纖維的數(shù)量平均66根左右，每根膠原原纖維的橫紋周期116.4 nm。與青年組大鼠比較，中年組大鼠真皮橫斷面膠原束疏散、膠原束間距大、排列較齊，束內(nèi)膠原原纖維間距顯著增大，排列均勻整齊；與青年組大鼠比較，老年組大鼠真皮橫斷面膠原束疏松、膠原束間距明顯增大、排列散亂，束內(nèi)膠原原纖維排列無(wú)序。與中年組大鼠比較，老年組大鼠橫斷面膠原束疏松、膠原束間距明顯增大、排列散亂，束內(nèi)膠原原纖維排列無(wú)序、粗細(xì)不勻，見(jiàn)圖3A、3B。

與青年組大鼠比較，中年組大鼠真皮橫斷面膠原原纖維直徑增大、橫紋周期縮短、間距增大、密度減少（P均＜0.05）；老年組大鼠真皮橫斷面膠原原纖維直徑減小、橫紋周期縮短、間距減小、密度增加（P均＜0.05）。與中年組大鼠比較，老年組大鼠橫斷面膠原原纖維直徑減小、橫紋周期縮短、間距減小、密度增加（P均＜0.05），見(jiàn)圖3C、3D、3E、3F。

圖3 不同年齡鼠真皮層膠原原纖維透射電鏡觀察

2.2 皮膚含水量、膠原蛋白、HYP變化

隨著年齡的增長(zhǎng)，與青年組大鼠相比，中年組、老年組大鼠皮膚含水量、膠原蛋白含量、HYP含量均下降（P均＜0.05），與中年組大鼠比較，老年組大鼠皮膚含水量、膠原蛋白含量、HYP含量均減少（P均＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 不同年齡鼠皮膚含水量、膠原蛋白和HYP的含量變化

2.3 皮膚MMP1、MMP12變化

與青年組相比，中年組、老年組的MMP1和MMP12活力均增強(qiáng)（P均＜0.05），與中年組比較，老年組的MMP1和MMP12活力均增強(qiáng)（P均＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 不同年齡鼠皮膚MMP1、MMP12的影響

2.4皮膚MMP1mRNA、MMP12mRNA的表達(dá)水平

與青年組相比，中年組、老年組的MMP1mRNA和MMP12mRNA表達(dá)水平均增高（P均＜0.05），與中年組比較，老年組MMP1mRNA和MMP12mRNA表達(dá)水平均增高（P均＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 不同年齡鼠皮膚MMP1、MMP12的mRNA表達(dá)水平

3 討論

皮膚老化與實(shí)際年齡、表觀年齡有密切關(guān)系[26]。膠原纖維是人體含量最多的一種纖維，由膠原蛋白、氨基酸、甘氨酸、脯氨酸和HYP、微量元素等組成[27-28]。膠原纖維廣泛分布于機(jī)體各器官內(nèi)，皮膚、鞏膜和肌腱最為豐富，也是皮膚的基本結(jié)構(gòu)物質(zhì)。而成纖維細(xì)胞分泌MMP1降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，巨噬細(xì)胞分泌MMP12降解彈力纖維[24，29]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP1、MMP12水平增高，與大鼠真皮中膠原纖維和彈力纖維含量呈年齡依賴性下降。同時(shí)，膠原蛋白代謝產(chǎn)物HYP也隨年齡增加含量下降，表明皮膚膠原肽鍵和彈力網(wǎng)斷裂，其螺旋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞?；|(zhì)金屬蛋白酶在皮膚老化中激活，對(duì)于皮膚時(shí)序性老化具有重要作用。

本文從超微結(jié)構(gòu)證實(shí)膠原原纖維的退化。膠原原纖維是構(gòu)成膠原纖維的超微結(jié)構(gòu)單位，形成膠原原纖維的基本單位則是原纖維膠原蛋白，膠原蛋白（或稱膠原）是由3條α多肽鏈形成的三股螺旋結(jié)構(gòu)，這也是膠原蛋白的基本特征。原纖維膠原蛋白在成纖維細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上自我裝配受到一定程度破壞。皮膚膠原纖維的抗張強(qiáng)度與膠原原纖維的數(shù)量、直徑、排列、間距有密切的關(guān)系[30]。本研究觀察了自然老化鼠膠原原纖維變化，結(jié)果證實(shí)隨年齡增長(zhǎng)膠原原纖維呈時(shí)序性退化。

綜上所述，皮膚老化是評(píng)價(jià)機(jī)體老化程度的重要外在表現(xiàn)。同時(shí)，皮膚與機(jī)體其他組織不同，不僅受外源性老化的影響，還受內(nèi)源性老化的影響，但內(nèi)源性老化占主導(dǎo)作用。目前，大多研究皮膚老化模型多聚焦在單一外在因素的模型制備，而最新的皮膚老化理論考慮年齡和環(huán)境等多因素的作用，是反映皮膚老化的合理模型，年齡因素為內(nèi)源性和外源性因素重疊。本文通過(guò)電鏡深入觀察其亞微結(jié)構(gòu)膠原原纖維的年齡時(shí)序性變化，為真皮膠原纖維退化提供了新佐證，為皮膚美容、皮膚疾病治療、研發(fā)新藥物提供理論依據(jù)。