C反應(yīng)蛋白基因?qū)ep G2.215細(xì)胞株乙型肝炎病毒復(fù)制的影響

李 娟，馬麗娜，劉帥偉，雒 夏，丁向春

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染性疾病科，銀川 750004）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關(guān)肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球嚴(yán)重威脅人類健康常見的惡性腫瘤之一。在癌癥病死率中排第2位，在受影響較多的亞洲和非洲等地區(qū)，超過50%的肝癌病例與HBV感染有關(guān)[1]。在我國95%以上的HCC與HBV感染相關(guān)[2]，HBV引起全球約3億例患者的感染流行[3]，每年有近90萬人死于包括肝衰竭、HCC等HBV導(dǎo)致的并發(fā)癥。C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）為組織損傷、炎癥、感染相關(guān)的急性期反應(yīng)蛋白，不但具有免疫調(diào)節(jié)功能，而且在腫瘤的發(fā)生、生長中起到重要的作用[4-6]。CRP可通過影響轉(zhuǎn)錄激活因子-3（STAT3）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）及干擾素相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控HBV的復(fù)制[7]，CRP還與血清乙型肝炎病毒DNA（HBVDNA）復(fù)制水平相關(guān)[8]，在HBV相關(guān)的HCC中，炎癥因子CRP如何通過影響HBV復(fù)制進而影響HCC的發(fā)生進展，鮮有相關(guān)報道，這對進一步認(rèn)識HCC的發(fā)生機制有重要的作用。

HepG2是人肝癌細(xì)胞株，HepG2.215細(xì)胞是一種能穩(wěn)定分泌HBV顆粒的人類肝癌細(xì)胞模型，常用于研究HBV復(fù)制機制，也是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染困難且轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞模型。慢病毒載體具有目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染效率高且對轉(zhuǎn)染細(xì)胞影響較小的特點，因此，本研究利用HBV復(fù)制細(xì)胞模型HepG2.215，采用CRP基因過表達(dá)、沉默及突變慢病毒載體轉(zhuǎn)染HepG2.215細(xì)胞技術(shù)獲得HepG2.215穩(wěn)定表達(dá)CRP細(xì)胞株，分析CRP對肝癌細(xì)胞中HBV復(fù)制的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 肝癌細(xì)胞株HepG2和HepG2.215細(xì)胞（保存于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病原微生物實驗室）。

1.1.2 試劑及儀器 CRP過表達(dá)慢病毒載體及空載體、CRP沉默慢病毒載體及空載體、CRP突變慢病毒載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；RNAiso Plus（日本Takara公司）；FBS、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；引物（合肥通用生物公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；鼠抗人CRP單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG（H+L）（美國Abcam公司）；HBVDNA檢測試劑盒（杭州博日公司）；HBsAg、HBeAg ELISA試劑盒（中國恩必普公司）；乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）抗體（美國Abcam公司）；SDS-PAGE電泳儀（美國Bio-Rad公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron Corporation公司），Nano Drop 2000（美國Thermo Fisher scientific公司），透射電鏡儀（日本JEOL公司），定量PCR儀（美國Applied biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2.215細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素、100μg·mL-1的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞增殖到80%～90%時按1∶3進行傳代。

1.2.2 轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株篩選 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，制備HepG2.215細(xì)胞懸液，按每孔細(xì)胞數(shù)為5×105個接種細(xì)胞至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%時，將CRP過表達(dá)慢病毒載體、CRP慢病毒空載體、CRP沉默慢病毒載體和CRP突變慢病毒載體分別感染肝癌細(xì)胞株HepG2.215細(xì)胞。慢病毒感染的細(xì)胞在最佳感染復(fù)數(shù)濃度（20∶1）加入病毒上清液（參照預(yù)實驗結(jié)果），轉(zhuǎn)染24 h后用含有嘌呤霉素（終濃度為1μg·mL-1）的培養(yǎng)基傳代篩選HepG2.215穩(wěn)定株，72 h后收集穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，用RT-qPCR、Western blot檢測感染效果及進行相關(guān)實驗研究。實驗組為HepG2.215+CRP組、HepG2.215+sh-CRP組、HepG2.215+CRP-mut組（分別轉(zhuǎn)染CRP過表達(dá)、沉默、突變載體慢病毒），陰性對照組為HepG2.215+NC組、HepG2.215+sh-NC組（分別轉(zhuǎn)染CRP慢病毒空載體），未經(jīng)任何處理的HepG2、HepG2.215為空白對照組。

1.2.3 PCR檢測

1.2.3.1 熒光定量PCR檢測HBVDNA、乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA（HBVcccDNA）水平 將各組HepG2.215細(xì)胞培養(yǎng)在上述DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，吸取細(xì)胞上清移至無RNA酶EP管中，按HBVDNA檢測試劑盒說明操作：在0.5 mL離心管中分別加入100μL上清、溶液A和5μL內(nèi)標(biāo)混勻，離心（13 000 r·min-1、10 min），棄上清，再加25μL溶液B振蕩，沸水浴10 min，離心（13 000 r·min-1、10 min），留上清-20℃保存?zhèn)溆?。按?biāo)本數(shù)量加標(biāo)準(zhǔn)品和對照品，配制PCR反應(yīng)液，以每管38μL分裝于0.2 mL的PCR反應(yīng)管，再加入已提取好的標(biāo)本、對照品及標(biāo)準(zhǔn)品各2μL。設(shè)置程序進行HBVDNA定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃2 min，95℃5 s，60℃40 s，40個循環(huán)。PCR擴增完畢后進行熔解曲線分析，結(jié)合內(nèi)參，按公式（2-△△Ct法分析）每份標(biāo)本均行3個復(fù)孔測平均值。HBVcccDNA檢測方法同HBVDNA，引物見表1。

1.2.3.2 RT-qPCR檢測CRPmRNA、HBVmRNA、前基因組RNA（HBVpgRNA）的表達(dá)水平 將各組HepG2.215細(xì)胞培養(yǎng)在上述DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，按照trizol法提取總RNA，RNA經(jīng)NanoDrop 2000紫外分光光度計測定濃度，將總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)cDNA，根據(jù)SYBR Green熒光染料法定量檢測各組細(xì)胞中CRPmRNA的表達(dá)水平。熒光定量PCR反應(yīng)采用20μL體系，各組細(xì)胞cDNA 2μL，上下游引物各0.4μL，ddH2O 7.2μL，SYBR Green solution 10μL。反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃5 s，60℃1 min，40個循環(huán)。PCR擴增完畢后進行熔解曲線分析，結(jié)合內(nèi)參，按公式（2-△△Ct法分析）每份標(biāo)本均行3個復(fù)孔測平均值。HBVmRNA、HBVpgRNA檢測方法同CRPmRNA，引物設(shè)計見表1。

表1 PCR中的引物序列

1.2.4 Western blot檢測 將收集的各組細(xì)胞裂解離心，將上清根據(jù)二辛可寧酸（BCA）測定試劑盒說明測定總蛋白濃度，依次進行清洗玻璃板、灌膠、上樣蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）將蛋白樣品分離轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，5%牛血清白蛋白（BSA）的洗膜緩沖液（TBST）按1∶1 000稀釋一抗4℃孵育過夜，二抗按1∶5 000稀釋室溫孵育2 h，按照試劑盒說明于Thermo ECL進行化學(xué)發(fā)光，Tanon凝膠成像儀下拍照取片。采用Image J軟件測定各組條帶灰度值，以各蛋白灰度值與相應(yīng)內(nèi)參（GAPDH）灰度值比值進行相對定量分析。

1.2.5 乙肝病毒核心抗原（HBcAg）免疫熒光檢測 收集的細(xì)胞株加入DMEM完全培養(yǎng)基中置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞增殖至80%～90%時，胰酶消化并傳代。將1×106個細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁。經(jīng)4%多聚甲醛固定并加含0.5%Triton X-100的PBS，穿刺細(xì)胞膜10 min。磷酸緩沖液（PBS）洗滌并加入PBS-3%BSA，常溫封閉30 min。將HBcAg抗體按照1∶100的比例稀釋，加一抗室溫孵育2 h。去除一抗，將熒光二抗按1∶400稀釋，加二抗室溫避光孵育1 h。去除二抗洗滌并加入100 ng·mL-1DAPI溶液室溫避光孵育10 min。洗滌后加防熒光淬滅溶液4℃避光放置或直接在激光共聚焦熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 透射電鏡檢查 將各組收集的細(xì)胞進行洗滌、胰酶消化，置于離心管1 000 r·min-1，常溫離心5 min，PBS重懸細(xì)胞，常溫離心5 min，加2.5%戊二醛4℃固定細(xì)胞過夜。經(jīng)PBS漂洗于室溫下用1%細(xì)胞去除培養(yǎng)基，PBS洗滌、胰酶消化2 min，將細(xì)胞移至15 mL離心管，常溫1 000 r·min-1，離心5 min。PBS重懸細(xì)胞再次常溫1 000 r·min-1，離心5 min，2.5%戊二醛4℃固定細(xì)胞過夜。PBS洗滌后室溫用1%四氧化鋨固定樣品1 h，用10%明膠包埋固定；在4℃環(huán)境戊二醛固定1 h，后用濃度遞增的乙醇溶液脫水，用環(huán)氧樹脂浸透包埋，用LeicaUC6切片機切片后，于透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并拍攝照片。

1.2.7 ELISA檢測上清乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和乙肝病毒E抗原（HBeAg） 將收集的細(xì)胞取上清經(jīng)4℃、12 000 r·min-1，離心10 mim。Biotin標(biāo)記的抗體、HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白、標(biāo)準(zhǔn)品蛋白等按試劑盒操作分別進行稀釋。將標(biāo)準(zhǔn)品和培養(yǎng)上清加入96孔板，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，貼封口膜于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后去除溶液，每孔加入100μL生物素標(biāo)記的抗體貼封口膜，放入培養(yǎng)箱1 h后沖洗，同樣方法加入100μL HRP標(biāo)記的抗生物重復(fù)上述操作，1 h后加入90μL TMB反應(yīng)底物，37℃培養(yǎng)箱中避光孵育。每孔加入90μL終止緩沖液混勻，在酶標(biāo)儀上450 nm波長處檢測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出各組樣品濃度進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRP基因過表達(dá)及沉默的效果驗證

與HepG2組比較，空白組HepG2.215細(xì)胞中CRP蛋白及CRPmRNA表達(dá)均升高（P均＜0.05）。與HepG2.215+NC組比較，HepG2.215+CRP組細(xì)胞中CRP蛋白及CRPmRNA表達(dá)均升高，與HepG2.215+sh-NC組相比，HepG2.215+sh-CRP組CRP蛋白及CRPmRNA均降低（P均＜0.05），見圖1。

圖1 細(xì)胞中CRP過表達(dá)及沉默效果鑒定

2.2 CRP基因過表達(dá)及沉默對HepG2.215細(xì)胞HBVcccDNA、HBVpgRNA的影響

與HepG2.215+NC組相比，HepG2.215+CRP組細(xì)胞中HBVcccDNA、HBVpgRNA表達(dá)升高；與HepG2.215+sh-NC組相比，HepG2.215+sh-CRP組細(xì)胞HBVcccDNA、HBVpgRNA表達(dá)均降低（P均＜0.05），見圖2。

圖2 HepG2.2.15中HBVcccDNA、HBVpgRNA的表達(dá)

2.3 CRP基因過表達(dá)及沉默對HepG2.215細(xì)胞HBcAg影響

與HepG2.215+NC組比較，HepG2.215+CRP組細(xì)胞核中HBcAg免疫熒光信號較明顯，與HepG2.215+sh-NC組比較，HepG2.215+sh-CRP組細(xì)胞核中HBcAg免疫熒光信號明顯較弱。表明CRP的表達(dá)促進HBcAg分泌，見圖3。

圖3 免疫熒光顯示HepG2.215細(xì)胞核中HBcAg表達(dá)（×100）

2.4 透射電鏡下觀察HepG2.215細(xì)胞HBV病毒復(fù)制情況

病毒包涵體是病毒感染細(xì)胞的標(biāo)志，在感染細(xì)胞內(nèi)顯示高密度斑塊影，呈圓形、卵圓形等，內(nèi)含有病毒顆粒，細(xì)胞線粒體為有嵴和雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，可與包涵體區(qū)別。本實驗中不同處理組細(xì)胞內(nèi)病毒包涵體和病毒顆粒發(fā)生了顯著變化，提示不同處理組HepG2.215細(xì)胞中病毒復(fù)制過程不同。與HepG2.215+NC組相比，HepG2.215+CRP組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成了多數(shù)類似液泡狀大小的圓形、卵圓形病毒包涵體，部分包涵體內(nèi)又發(fā)現(xiàn)類似多泡體樣結(jié)構(gòu)的大量電子致密的病毒樣顆粒；與HepG2.215+sh-NC組相比，HepG2.215+sh-CRP組細(xì)胞亦發(fā)現(xiàn)部分病毒包涵體，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞內(nèi)病毒包涵體較少。HepG2.215+NC組與HepG2.215+sh-NC組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)部分病毒包涵體，見圖4。

圖4 HepG2.215細(xì)胞透射電鏡檢查（1μm）

2.5 CRP基因過表達(dá)、沉默及突變對HepG2.215細(xì)胞HBV復(fù)制的影響

與空白對照組HepG2.215相比，HepG2.215+CRP組細(xì)胞HBsAg、HBeAg表達(dá)均升高，HepG2.215+sh-CRP組細(xì)胞HBsAg、HBeAg表達(dá)均降低（P均＜0.01）。與空白對照組HepG2.215相比，HepG2.215+CRP-mut組HBsAg表達(dá)升高（P＜0.01），見圖5。

圖5 Hep G2.215細(xì)胞中的HBsAg、HBeAg表達(dá)

與空白對照組HepG2.215相比，HepG2.215+CRP組細(xì)胞HBVmRNA、HBVDNA表達(dá)升高，HepG2.215+sh-CRP組細(xì)胞HBVmRNA、HBVDNA表達(dá)降低（P均＜0.05）。與空白對照組HepG2.215比較，HepG2.215+CRP-mut細(xì)胞中HBVmRNA、HBVDNA表達(dá)無明顯變化（P均＞0.05），見圖6。

圖6 HepG2.215細(xì)胞中HBVmRNA、HBVDNA的表達(dá)

3 討論

CRP是1930年Tillet和Francis發(fā)現(xiàn)的一種由肝臟生成的與機體的損傷、炎癥、感染相關(guān)的急性期敏感性反應(yīng)蛋白[9]。CRP的表達(dá)在基因水平上主要受白細(xì)胞介素-6（IL-6）調(diào)控，CRP作為炎癥相關(guān)蛋白，既往多用于評價系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)與預(yù)后。CRP在多種惡性腫瘤中濃度升高，卵巢癌[10]、肺癌[11]、淋巴瘤[12]等患者的血清中CRP檢測為高濃度，CRP也被作為腫瘤篩查預(yù)后的標(biāo)志物。HBV高復(fù)制狀態(tài)及持續(xù)的慢性感染導(dǎo)致的炎癥持續(xù)慢性修復(fù)是HBV相關(guān)HCC發(fā)生、進展的主要原因。CRP與慢性乙型肝炎患者的肝損害程度、肝纖維化相關(guān)[8]，在HBV相關(guān)慢性疾病及肝癌中呈高表達(dá)，且與肝癌的預(yù)后密切相關(guān)。

本實驗中，與陰性對照組比較，CRP基因過表達(dá)使細(xì)胞中HBVcccDNA、HBVpgRNA的表達(dá)升高；與陰性對照組比較，CRP基因沉默抑制細(xì)胞HBVcccDNA、HBVpgRNA表達(dá)。HBVcccDNA是所有病毒基因產(chǎn)物包括HBVpgRNA的轉(zhuǎn)錄模板，也是HBV循環(huán)復(fù)制及持續(xù)感染的獨立危險因素之一[13]。在慢性HBV感染患者中，停止治療或免疫調(diào)控喪失，肝細(xì)胞少量拷貝數(shù)的HBVcccDNA會重新激活病毒增殖，導(dǎo)致肝細(xì)胞中HBV的持續(xù)存在[14]。HBVpgRNA不僅為HBV的反轉(zhuǎn)錄模板，也是HBV聚合酶蛋白（Pol）和HBcAg的翻譯模板，它在HBV的生命周期中發(fā)揮了非常重要的作用[15]，可反映HBVcccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。HBV pgRNA表達(dá)反映慢性乙型肝炎患者肝臟的炎癥和纖維化程度[16]。CRP促進HBVcccDNA、HBVpgRNA的表達(dá)，增強了HBVcccDNA的活性及HBV復(fù)制能力，在促進HBV相關(guān)HCC形成中發(fā)揮了重要作用。

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，CRP基因過表達(dá)的細(xì)胞核中HBcAg免疫熒光信號較明顯；與陰性對照組比較，CRP基因沉默組細(xì)胞核中HBcAg免疫熒光信號較弱。表明CRP增強肝癌細(xì)胞HepG2.215中HBcAg在細(xì)胞核中表達(dá)。HBcAg是HBV的核衣殼蛋白，通常被HBsAg包裹，主要表達(dá)在胞核，在血清中很難檢出，與HBV核酸轉(zhuǎn)運相關(guān)。HBcAg具有很強的免疫原性，刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，細(xì)胞核HBcAg表達(dá)陽性患者有較高HBV復(fù)制水平，HBcAg水平與肝臟炎癥活動及纖維化進展密切相關(guān)[17]。

與空白對照組HepG2.215相比，CRP過表達(dá)組HBsAg、HBeAg和HBVmRNA、HBVDNA表達(dá)升高，CRP沉默組HBsAg、HBeAg和HBVmRNA、HBVDNA表達(dá)均降低。HBsAg常作為HBV感染的血清學(xué)標(biāo)記物，不僅反映肝內(nèi)HBV的活性，而且可以很好評價抗病毒藥物的療效[18]。研究[19]表明，血清HBsAg與HBVcccDNA以及HBsAg與肝細(xì)胞內(nèi)HBVDNA都存在很好的相關(guān)性，既可反映肝細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA的表達(dá)含量，HBV慢性感染患者的血清HBsAg滴度也一定程度上反映HBV的復(fù)制水平。HBsAg定量和HBVDNA定量水平與肝硬化在慢性乙肝基礎(chǔ)上進展的肝病等級均呈負(fù)相關(guān)[20]，這可能因為HBV感染相關(guān)疾病的狀態(tài)、病程進展、基因型及抗病毒治療等因素的影響導(dǎo)致實驗結(jié)果不統(tǒng)一。血清HBeAg是由HBV病毒S基因表達(dá)的一種病毒包膜蛋白質(zhì)，可持續(xù)分泌于細(xì)胞外，研究報道，HBeAg陽性往往提示病毒復(fù)制活躍，表明患者的肝細(xì)胞損傷較重且傳染性較強[21]。慢性乙型肝炎患者血清HBeAg定量與HBVcccDNA兩者具有正相關(guān)性[22]。HBVmRNA為HBVDNA轉(zhuǎn)錄水平，HBVmRNA表達(dá)量與HBVDNA表達(dá)呈正相關(guān)，HBVmRNA升高表明血清HBV的病毒載量HBVDNA轉(zhuǎn)錄生成增多，可反映出HBV的復(fù)制和活動狀況，HBVDNA也常常用于評價抗病毒治療的效果和作為評估病毒復(fù)制的指標(biāo)。上述各項有關(guān)HBV復(fù)制的相關(guān)標(biāo)記物，均能一定程度反映HBV復(fù)制的狀態(tài)。HBV在活動過程中還會激活人類免疫系統(tǒng)，加重病毒的感染，嚴(yán)重時引起肝臟纖維化[23]，導(dǎo)致疾病迅速進展。透射電鏡檢測結(jié)果再次為CRP促進肝癌細(xì)胞HepG2.215 HBV病毒復(fù)制提供了最直觀的證據(jù)，以上結(jié)果表明：CRP影響肝癌細(xì)胞HepG2.215中HBV復(fù)制和相關(guān)抗原HBsAg、HBeAg、HBcAg蛋白的表達(dá)，CRP參與HBV相關(guān)HCC的形成過程。

CRP作為炎癥因子，是炎癥相關(guān)信號通路白介素-6-轉(zhuǎn)錄激活因子-3（IL-6-STAT3）的關(guān)鍵效應(yīng)分子，通過炎癥因子及炎癥信號通路在機體發(fā)揮作用，對于HBV引起的炎癥相關(guān)性腫瘤HCC，有著潛在致癌因素，IL-6/STAT3通路被認(rèn)為是“炎癌轉(zhuǎn)化”的關(guān)鍵紐帶，也是STAT3在癌細(xì)胞中過度活化的重要原因[24]，CRP如何通過炎癥信號作用于HBV病毒復(fù)制的各個環(huán)節(jié)，通過增強HBV復(fù)制活動而導(dǎo)致HCC的發(fā)生，有待于進一步研究探索。