槐定堿通過促進自噬改善急性肺損傷小鼠的炎癥反應(yīng)

湯業(yè)珍，彭 茜，張 玲，馬小霞，韓懷欽，梁錦屏，2

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床病原生物重點實驗室，銀川 750004）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種以肺部炎癥和微血管通透性增加為特征的臨床綜合征，由多種致病因素引起[1]，其病理特征是炎性細胞浸潤和炎性介質(zhì)的大量產(chǎn)生[2]，并伴隨肺泡上皮細胞和巨噬細胞的異常凋亡等[3]，肺實質(zhì)細胞死亡是ALI的基礎(chǔ)。自噬是一種高度保守的分解代謝過程，涉及細胞成分的自噬溶酶體降解，是維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激適應(yīng)的重要過程[4]，有研究表明，激活自噬能有效改善肺部炎性反應(yīng)[5-6]，因此，探究自噬在ALI中的作用將為防治ALI提供重要的理論支撐。

槐定堿（sophoridine，SRI）是天然產(chǎn)物中含量較豐富的生物堿之一，具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗菌、抗癌等，其有可能成為抗癌有效的、可選擇的和耐受性良好的候選藥物[7]，目前已用于惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤的治療。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SRI在體內(nèi)外具有抗炎作用，并對內(nèi)毒素血癥小鼠模型顯示出明顯的防治效應(yīng)[8-9]。一些藥物在治療ALI時也與自噬有關(guān)，如大麻素受體2的激活可以抑制炎癥細胞因子的釋放，從而緩解內(nèi)毒素性肺損傷[10]；人參皂苷Rg1可能通過激活自噬和核轉(zhuǎn)錄因子為ALI提供預(yù)防和治療策略[11]；雷帕霉素通過增加自噬和降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而顯著抑制小鼠單核巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-18（IL-18），保護小鼠免受脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的ALI[12]。這些藥物均通過促進自噬抑制ALI，提示SRI減輕ALI或與自噬有關(guān)，因此本研究采用內(nèi)毒素的主要成分LPS構(gòu)建ALI小鼠模型，從自噬的角度探究SRI抑制小鼠ALI的炎性反應(yīng)作用機制，并探究SRI對自噬及炎性反應(yīng)的動態(tài)調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用SPF級C57BL/6小鼠，共60只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物質(zhì)量合格證號為SCXK（京）2016-0006，通過倫理審核（寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理第2021-991號），所有動物飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，自由飲食。

1.1.2 儀器與試劑 SRI（MB7130，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；LPS（L2630，Sigma公司）；抗體LC3Ⅱ/Ⅰ（L7543，Sigma）；P62（39749，Cell Signaling Technology）；Beclin1（WL02508，沈陽萬類生物科技有限公司）；全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光液（Amersham，美國）；ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司），測試儀器為Rayto RT-6100。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建小鼠ALI模型 選取6～8周齡，60只18～22 g的C57BL/6小鼠隨機分為6組，陰性對照組（NS對照組）、SRI對照組、LPS組、SRI（1 h、2 h、4 h）+LPS組，每組10只。NS對照組注射等量生理鹽水，SRI對照組和SRI（1 h、2 h、4 h）+LPS組腹腔注射SRI（12 mg·kg-1）（參考預(yù)實驗結(jié)果，小鼠腹腔注射SRI LD50為58.0 mg·kg-1，本實驗選用SRI 1/5 LD50劑量為12 mg·kg-1）1 h、2 h、4 h后，5%水和氯醛（0.6 mL/10 g）麻醉，將小鼠垂直懸掛于細線上，采用非暴露式氣管滴注法將LPS（5 mg·kg-1）滴注入LPS組和SRI（1 h、2 h、4 h）+LPS組小鼠氣管誘導(dǎo)ALI模型。NS對照組滴注等量生理鹽水，小鼠垂直懸掛1～2 min，確保LPS溶液進入氣管并均勻分布在小鼠肺部，LPS刺激24 h后取材。

1.2.2 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化 無菌取小鼠左肺組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋切片，HE染色。鏡下觀察小鼠肺組織炎性病變程度，并按5分制方法進行評分，評分原則以肺組織中的炎性細胞浸潤范圍為標(biāo)準(zhǔn)：0=0%；1=0～12.5%；2=12.5%～25%；3=25%～50%；4=50%～75%；5=75%～100%，每個切片選取5個視野，計算平均病變率[13]。

1.2.3 ELISA法檢測小鼠血清炎癥因子的含量 摘眼球收集小鼠外周血，室溫靜置2 h，15 000×g離心5 min，取血清，ELISA法檢測炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.4 Western blot法檢測小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白的表達 提取小鼠肺組織蛋白，BCA法定量。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量為40μg/10μL。電泳（80 V，30 min后轉(zhuǎn)至120 V）；轉(zhuǎn)膜（80 V，90 min）；將膜放置于5%脫脂牛奶中封閉2 h；PBS洗5次，每次6 min；孵育一抗（一抗稀釋比例為1∶1 000），4℃過夜，次日室溫孵育1 h；PBS洗5次，每次6 min；孵育HRP標(biāo)記的二抗（二抗稀釋比例為1∶5 000），室溫2 h后PBS洗5次，每次6 min。使用Western blot印跡膜/凝膠成像儀獲得圖像，采用Image J分析系統(tǒng)對條帶半定量分析。

1.2.5 免疫組化法檢測小鼠肺組織LC3蛋白的表達 小鼠肺組織切片，常規(guī)脫蠟，抗原抗體修復(fù)液煮3 min，冷卻后放入0.03%H2O2中10 min，PBS浸泡3次，每次4 min，滴加山羊血清覆蓋組織37℃封閉30 min，PBS清洗3次，滴加LC3一抗（1∶150）37℃孵育2 h，PBS清洗后滴加HRP標(biāo)記的二抗（1∶50）室溫孵育2 h，PBS清洗后DAB顯色。鏡下觀察LC3蛋白陽性表達呈棕褐色，結(jié)果經(jīng)Image J分析切片組織陽性染色程度，GraphPad軟件作圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SRI對ALI小鼠肺組織HE染色及病理評分的影響

NS對照組與SRI對照組肺組織病理無差異，提示SRI對正常小鼠肺組織結(jié)構(gòu)無影響；與NS對照組和SRI對照組相比，LPS組低倍鏡下炎性細胞浸潤范圍＞70%，高倍鏡下清晰可見肺泡壁明顯充血，大量炎性細胞浸潤，肺泡間質(zhì)增厚，這表明小鼠ALI模型建立成功；SRI預(yù)處理可明顯減輕上述病理炎癥改變，見圖1A、1B。肺組織病理評分結(jié)果與上述結(jié)果一致，SRI（1 h、2 h、4 h）+LPS組肺組織評分均相對LPS組降低（P均＜0.05）；與SRI（1 h）+LPS組相比，SRI（2 h）+LPS組和SRI（4 h）+LPS組病理評分也均降低（P均＜0.05），見圖1C。

圖1 SRI對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織病理學(xué)影響

2.2 SRI對小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子的影響

LPS組較NS對照組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量升高（P均＜0.01）；與LPS組相比，SRI（1 h、2 h、4 h）+LPS組以上因子含量均下降（P均＜0.05）。SRI（4 h）+LPS組較SRI（2 h）+LPS組IL-1β含量下降（P＜0.05），但IL-6、TNF-α含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見圖2。

圖2 SRI對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的影響

2.3 SRI對自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的影響

與NS對照組相比，LPS組自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達上升，P62表達下降；與LPS組相比，SRI（1 h、2 h、4 h）+LPS組P62蛋白表達降低，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達增加，SRI（2 h、4 h）+LPS組Beclin1蛋白表達增加（P均＜0.05）；與SRI（1 h）+LPS組相比，SRI（2 h）+LPS組P62蛋白表達降低（P＜0.05），SRI（2 h）+LPS組和SRI（4 h）+LPS組Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達均升高（P均＜0.05），見圖3。

圖3 SRI對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達的影響

2.4 SRI對小鼠肺組織LC3蛋白表達的影響

免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠肺組織LC3蛋白的表達，LC3主要分布于胞質(zhì)中，陽性表達為深淺不一的棕褐色，如圖4A所示LC3蛋白的陽性表達，NS對照組陰性表達為藍色，SRI干預(yù)ALI小鼠后，LC3蛋白表達量高于NS對照組和LPS組。與NS對照組相比，LPS組LC3表達升高，而SRI（1 h、2 h、4 h）+LPS組與LPS組相比LC3蛋白表達升高，與SRI（1 h）+LPS組相比，SRI（2 h）+LPS組LC3蛋白表達升高（P均＜0.05），但與SRI（4 h）+LPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4B。

圖4 SRI對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織LC3表達的影響

3 討論

ALI是以炎癥爆發(fā)為特征的肺部疾病，導(dǎo)致嚴(yán)重的低氧血癥、高碳酸血癥、彌漫性浸潤和不良的肺順應(yīng)性[14]。SRI的同體異構(gòu)物苦參堿可通過多種途徑在不同細胞中誘導(dǎo)自噬反應(yīng)的提高[15-16]，然而有關(guān)SRI調(diào)控自噬的研究國內(nèi)外鮮有報道，其對機體免疫功能的影響研究也甚少。因此本課題探討SRI調(diào)控自噬對內(nèi)毒素性肺損傷的保護作用，明確SRI抗內(nèi)毒素的藥理機制，為治療內(nèi)毒素血癥引發(fā)的危重疾病提供科學(xué)依據(jù)。

LPS通過刺激多種炎癥信號通路導(dǎo)致各種炎癥因子過度釋放誘導(dǎo)產(chǎn)生ALI，TNF-α、IL-1β與IL-6是ALI啟動的重要炎癥因子[17]。有文獻表明LPS誘導(dǎo)的ALI相關(guān)炎癥因子異常增高[18]，本研究結(jié)果顯示，與NS對照組相比，LPS處理后各組小鼠肺組織病理明顯加重，血清炎癥因子TNFα、IL-1β、IL-6分泌增加，表明內(nèi)毒素性ALI小鼠模型構(gòu)建成功。氧化SRI和氧化苦參堿對小鼠ALI具有一定的保護作用[19-20]，本研究發(fā)現(xiàn)SRI不同時間預(yù)處理后均有效緩解小鼠肺損傷且降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，因此SRI可能通過減少炎癥因子分泌從而抑制LPS引起的ALI。本研究進一步探討了SRI、自噬和ALI三者的關(guān)系。

細胞自噬存在于幾乎所有真核細胞中，通常被認(rèn)為是細胞在面對眾多應(yīng)激源時維持正常生理功能的一種反應(yīng)，在生理過程和許多疾病發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[21]。目前自噬相關(guān)的重要標(biāo)記物有Beclin1、LC3、P62等，Beclin 1可與P13K形成復(fù)合物，調(diào)控相關(guān)自噬蛋白質(zhì)定位于前自噬體[22]；LC3是檢測自噬發(fā)生的標(biāo)志性蛋白，自噬形成時，LC3會通過泛素樣反應(yīng)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3Ⅱ，LC3Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計自噬水平的高低[23-24]，研究結(jié)果顯示LPS可誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表達，推測可能是由于機體受到LPS攻擊后產(chǎn)生的一種自我保護性反應(yīng)，而SRI處理后能提高LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白比值和Beclin1蛋白活化水平，降低P62蛋白表達[25]，這表明SRI可通過促進ALI小鼠發(fā)生自噬反應(yīng)，調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達。促進自噬能夠減輕ALI和氣道炎癥，降低P62蛋白的表達，上調(diào)LC3在肺組織中的表達[8]，這與本研究的實驗結(jié)果一致。自噬與炎癥有著密切的關(guān)系，自噬過程涉及許多自噬相關(guān)蛋白，這些蛋白可以吞噬并殺死病原體以保護細胞免受病原體的侵襲，并抑制炎癥小體和炎癥因子的分泌。綜上所述，SRI可能通過在體內(nèi)促進細胞自噬抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌從而緩解肺損傷。

雖然本實驗表明SRI可以通過促進自噬減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI以及減少炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮保護作用。然而，Wang等[26]通過ALI小鼠模型發(fā)現(xiàn)，細胞自噬的過度激活也是導(dǎo)致ALI的一個重要機制，抑制細胞過度自噬能起到減輕肺部損傷的作用。部分藥物可通過抑制自噬減輕ALI，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）可通過抑制自噬減輕炎癥對肺組織起到保護作用[27]；內(nèi)酯素通過調(diào)節(jié)自噬因子的表達，激活PI3K/AKT信號通路，降低肺泡上皮細胞凋亡率和ALI自噬水平，最終保護肺組織免受損傷[28]。這可能是由于不同藥物靶點與作用機制不同從而導(dǎo)致促進或者抑制自噬減輕ALI，這種對細胞自噬的雙向調(diào)控為防治ALI提供新的方向。

本研究認(rèn)為SRI可以通過促進自噬減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI以及減少炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮保護作用。有研究表明，通過調(diào)控自噬保護ALI的作用可能與Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）、雷帕霉素靶蛋白mTOR信號通路有關(guān)[29-30]，因此，今后將探討SRI調(diào)控自噬對ALI發(fā)揮保護作用是否涉及上述通路，并進行相關(guān)實驗驗證。