基于PINK1/Parkin信號通路研究MEHP對小鼠睪丸間質(zhì)細胞線粒體自噬的影響

宋貝貝，李 玲，2，3，德小明，2，3，李麗萍，2，3，黃金瑞，郭曉英，馬慧穎

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，銀川 750004；2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004；3.生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004）

作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的一種，鄰苯二甲酸酯類（phthalates，PAEs）物質(zhì)因其延展性強、耐高溫的特點被廣泛用于玩具、醫(yī)療材料、裝飾材料、化妝品甚至食品包裝中[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用最廣泛的為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP），其可通過消化道、皮膚等方式進入人體[2]，DEHP主要的代謝產(chǎn)物為鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（MEHP），代謝產(chǎn)物MEHP比其原形毒性更強，在人體蓄積時間更久，對人體危害作用更大[3]。

線粒體過度損傷將會導(dǎo)致細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水平降低和反應(yīng)性改變[4]。線粒體去極化是線粒體損傷后膜電位的一種變化趨勢，同時也是線粒體自噬過程中的一種早期現(xiàn)象[5-6]。細胞在氧化應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏以及細胞凋亡等因素影響下，會引起線粒體的功能改變[7]。

關(guān)于線粒體自噬的分子調(diào)節(jié)機制目前引起了普遍重視，由同源性磷酸酶張力蛋白誘導(dǎo)激酶1（PINK1）/帕金森蛋白（Parkin）途徑介導(dǎo)的線粒體自噬是目前研究發(fā)現(xiàn)最廣泛的，也是其經(jīng)典途徑之一[8]。PINK1蛋白穩(wěn)定存在于線粒體外膜上，并被細胞內(nèi)的蛋白酶所降解，在細胞內(nèi)呈低水平表達。當(dāng)線粒體受損，蛋白酶活性降低，使線粒體外膜上的PINK1蛋白水解過程受阻[9]，存在于胞漿中的Parkin被PINK1蛋白不斷募集至線粒體外膜上并被磷酸化為P-Parkin[10]。抗增殖蛋白2（PHB2）已經(jīng)被確定了是PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬不可缺少的受體蛋白，它也被認為是線粒體自噬的一種標(biāo)志蛋白[11]。

課題組前期實驗結(jié)果表明，MEHP可干擾小鼠睪丸間質(zhì)（TM-3）細胞線粒體功能[12]，但其對線粒體自噬的作用機制尚不清楚。因此本研究擬從PINK1/Parkin途徑探討MEHP對TM-3細胞線粒體自噬水平的影響，并通過自噬抑制劑3-3-甲基腺嘌呤（3-MA）進行驗證。

1 材料與方法

1.1 細胞株來源

TM-3細胞（ATCC細胞研究中心，美國）。

1.2 主要儀器

SW-CJ-1CU超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國），低溫高速離心機（Thermo Fisher Scientific公司，美國），CKX41倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），HF90 CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司，中國），成像系統(tǒng)（Azure Biosystems公司，美國），VICTOR Nivo酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司，美國）。

1.3 主要試劑

MEHP標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99%，Sigma公司，美國），3-MA（Sigma公司，美國），胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO）、青鏈霉素混合液（Gibco公司，美國）、胰酶（北京索萊寶科技有限公司，中國），CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，中國），ATP檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、ECL檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國），PHB2、PINK1、Parkin、P-Parkin、β-actin抗體（Proteintech公司，美國），其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4 TM-3細胞復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)及分組

將凍存的TM-3細胞從-80℃冰箱中取出，離心，棄去凍存液，加入4 mL新鮮配制的完全培養(yǎng)基，混勻后接種于培養(yǎng)瓶中。5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫37℃培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期的TM-3細胞，確立對照組（完全培養(yǎng)基）、MEHP低、中、高劑量組（200、400、800μmol·L-1，劑量均按本課題組前期研究結(jié)果設(shè)置[12]）和抑制劑組（400μmol·L-1MEHP+1.0 mmol·L-13-MA），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行相關(guān)檢測。

1.5 CCK-8法檢測TM-3細胞活性

取對數(shù)生長期的TM-3細胞，胰酶消化后配成細胞混懸液（細胞數(shù)約2×105個/mL），每孔100μL加入96孔板，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基并加入0、0.25、0.5、1.0、1.25、1.5 mmol·L-16個 濃 度梯度的3-MA。設(shè)置對照組、MEHP中劑量組和抑制劑組，培養(yǎng)箱中孵育24 h。各孔中加入10μL的CCK-8檢測液，孵育1～2 h后，酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔光密度（OD）值并計算細胞活力（%）=［（染毒組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）］×100%。

1.6 化學(xué)發(fā)光法檢測TM-3細胞ATP水平

取TM-3細胞混懸液（細胞數(shù)約2×105個/mL）接種于6孔板，培養(yǎng)至細胞貼壁，棄去培養(yǎng)基，設(shè)置對照組，MEHP低、中、高劑量組和抑制劑組。培養(yǎng)24 h后用事先冷藏的PBS洗1次，隨后裂解細胞。將細胞收集到1.5 mL的離心管中，4℃離心（12 000 r·min-1）5 min。ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為濃度梯度為0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μmol·L-1。配制適量的ATP檢測工作液于冰上保存。每個檢測管中先加入100μL ATP檢測工作液，并于室溫條件下放置3～5 min，減少背景值。將20μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品添加到檢測管中，間隔2 s后用化學(xué)發(fā)光儀測量相對光單位（relative light unit，RLU）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中ATP的濃度。

1.7 熒光探針JC-1法檢測TM-3細胞線粒體膜電位水平

將處于對數(shù)增殖期的TM-3細胞以2×105個/mL的密度接種于6孔板中，孵育24 h后，設(shè)置對照組、MEHP低、中、高劑量組和抑制劑組，細胞培養(yǎng)24 h。每孔細胞培養(yǎng)液和JC-1染色工作液各1 mL，混合均勻，孵育20 min。孵育期間，按照JC-1染色緩沖液（5×）和蒸餾水1∶4的比例，準(zhǔn)備適量的JC-1染色緩沖液（1×），冰浴。37℃孵育結(jié)束后，棄上清，裂解細胞并收集，4℃，600×g，離心3 min，沉淀細胞，棄上清。用1×JC-1染色緩沖液洗2次，加入1 mL的1×JC-1染色緩沖液重懸細胞，600×g，4℃，離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清。重復(fù)2次后用適量1×JC-1染色緩沖液使細胞重新懸浮。酶標(biāo)儀激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm檢測JC-1單體；激發(fā)光波長設(shè)置為525 nm，發(fā)射光波長設(shè)置為590 nm，檢測JC-1聚合物。

1.8 Western blot檢測TM-3細胞PHB2、PINK1、Parkin、P-Parkin蛋白表達水平

將處于對數(shù)增值期的TM-3細胞，以2×105個/mL的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿，細胞貼壁后分別設(shè)置對照組、MEHP低、中、高劑量組和抑制劑組，細胞培養(yǎng)24 h。棄去各組培養(yǎng)基，用事先預(yù)冷的PBS洗2次，裂解細胞，將細胞收集至1.5 mL的離心管中，振蕩30 s后在冰上放置4 min，重復(fù)操作5次后離心（4℃，12 000 r·min-1）5 min，得上清為全蛋白。測定蛋白濃度并對蛋白進行變性處理。配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2 h后加入一抗4℃冰箱過夜。二抗室溫孵育1 h后曝光。采用Image J軟件分析目的條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。每項實驗均重復(fù)3次以上，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3-MA抑制劑對TM-3細胞活性的影響

預(yù)實驗設(shè)置3-MA為0、0.25、0.5、1.0、1.25、1.5 mmol·L-16個濃度梯度，干預(yù)24 h后測定OD值。CCK-8結(jié)果顯示：TM-3細胞存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與對照組相比，1 mmol·L-13-MA處理TM-3細胞24 h后細胞存活率為（99.56±2.51）%（P＞0.05），見表1。確定后續(xù)3-MA抑制劑干預(yù)劑量為1 mmol·L-1。進一步檢測各處理組對于細胞活性的影響，結(jié)果表明：與對照組相比，MEHP中劑量組細胞存活率降低（P＜0.01）；與MEHP中劑量組相比，抑制劑組細胞存活率降低（P＜0.05），3組結(jié)果表現(xiàn)為：抑制劑組細胞存活率＜MEHP染毒組細胞存活率＜對照組，見表2。

表1 3-MA對TM-3細胞存活率的影響（±s）

表1 3-MA對TM-3細胞存活率的影響（±s）

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

3-MA濃度/（mmol·L-1）0 0.25 0.5 1.0 1.25 1.5 n 3 3 3 3 3 3細胞存活率/%100.00±0.00 116.70±4.16**106.28±2.32*99.56±2.51 81.96±3.21**71.35±2.08**

表2 CCK-8法檢測TM-3細胞存活率的變化（±s）

表2 CCK-8法檢測TM-3細胞存活率的變化（±s）

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與中劑量組比較#P＜0.05。

組別對照組中劑量組抑制劑組n 3 3 3細胞存活率/%100.00±0.00 47.68±3.16**39.56±2.51*#

2.2 MEHP染毒對TM-3細胞ATP水平的影響

與對照組相比，MEHP各染毒組均可引起TM-3細胞ATP水平下降（P均＜0.05）；與低劑量組相比，高劑量組TM-3的ATP水平下降（P＜0.05）；與中劑量組相比，高劑量組、抑制劑組TM-3的ATP水平均降低（P均＜0.05），見表3。

表3 不同濃度MEHP染毒對TM-3細胞ATP水平的影響（±s）

表3 不同濃度MEHP染毒對TM-3細胞ATP水平的影響（±s）

與對照組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與低劑量組相比$P＜0.05；與中劑量組相比#P＜0.05。

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組抑制劑組F值P值n 3 3 3 3 3 ATP相對水平/（nmol·g-1）9.01±0.58 7.53±1.30*7.44±0.21*6.74±0.41**$#5.83±0.26*#28.96＜0.05

2.3 MEHP染毒對TM-3細胞線粒體膜電位水平的影響

與對照組比較，中、高劑量組TM-3細胞線粒體膜電位均下降（P均＜0.05），隨著染毒濃度的增加，線粒體膜電位呈下降趨勢；與低劑量組相比，中、高劑量組TM-3細胞線粒體膜電位水平均下降（P均＜0.05）；與中劑量組相比，高劑量組、抑制劑組細胞線粒體膜電位水平均降低（P均＜0.05），見表4。

表4 MEHP對TM-3細胞線粒體膜電位的影響（±s）

表4 MEHP對TM-3細胞線粒體膜電位的影響（±s）

與對照組相比*P＜0.05；與低劑量組相比$P＜0.05；與中劑量組相比#P＜0.05。

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 JC-1紅色熒光聚合物 JC-1綠色熒光單體 紅色熒光聚合物/紅色熒光單體100.00±3.68 100.00±4.21 100.00±2.68 96.43±5.02 97.66±6.47 98.76±4.38 75.42±2.72 113.16±3.28 63.28±5.65*$70.62±4.33 125.82±2.56 55.23±3.27*$#抑制劑組 3 F值 114.3 P值 ＜0.05 66.93±1.32 140.28±0.34 44.17±0.85*#

2.4 MEHP染毒后TM-3細胞內(nèi)PHB2、PINK1、Parkin、P-Parkin蛋白表達水平變化

與對照組相比，MEHP各染毒組TM-3細胞PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白表達水平均升高（P均＜0.05）；低劑量組Parkin蛋白的表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量組Parkin蛋白的表達水平均低于對照組（P均＜0.05）；與低劑量組相比，中、高劑量組TM-3細胞中PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相對表達水平均上升（P均＜0.05），中、高劑量組TM-3細胞中Parkin蛋白相對表達水平均下降（P均＜0.05）；與中劑量組相比，高劑量組TM-3細胞中PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相對表達水平均上升（P均＜0.05），高劑量組TM-3細胞中Parkin蛋白相對表達水平下降（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同MEHP染毒對TM-3細胞線粒體自噬相關(guān)蛋白的影響

抑制劑組PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白的相對表達水平均低于中劑量組（P均＜0.05），Parkin蛋白的表達水平高于中劑量組（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同處理組對TM-3細胞線粒體自噬相關(guān)蛋白的影響

3 討論

DEHP為塑膠制品常用的一種塑化劑，無色、無味，因可作為食品包裝、化妝品以及玩具的原料，在日常生活中隨處可見，被列為人類潛在致癌物[13]。DEHP在腸道中經(jīng)過水解酶的作用后大部分代謝為毒性更強、作用更久的MEHP[14]。有機物被細胞攝入后，其中儲存的能量轉(zhuǎn)換為ATP。因此，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損后，最先受影響的是細胞的能量供應(yīng)系統(tǒng)，進而繼發(fā)一系列供能不足的反應(yīng)。線粒體自噬是維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要過程，其中研究最為廣泛的是PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬，它由PTEN誘導(dǎo)的PINK1和Parkin調(diào)節(jié)。正常情況下，線粒體外膜上的PINK1蛋白會被迅速水解，從而在細胞內(nèi)維持低表達水平。但線粒體受損時，線粒體膜電位降低，PINK1蛋白不會被水解，會穩(wěn)定地聚集于線粒體外膜上。其進一步招募Parkin蛋白轉(zhuǎn)位到受損線粒體的外膜上，激活Parkin的泛素化活性，線粒體外膜破損，繼而暴露線粒體內(nèi)膜蛋白PHB2，從而進一步激活PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬下游通路。線粒體外膜破裂后暴露出的PHB2是與吞噬泡上LC3蛋白結(jié)合的一個關(guān)鍵位點，PHB2的缺失將會導(dǎo)致吞噬泡不能識別受損線粒體，阻斷線粒體自噬[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，MEHP所致的雄性生殖毒性機制涉及多種病理學(xué)變化，包括線粒體損傷和自噬功能障礙等。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著染毒劑量增加，細胞內(nèi)ATP含量逐漸減少，中、高劑量組線粒體膜電位下降，提示MEHP染毒后TM-3細胞線粒體發(fā)生了損傷，線粒體ATP合成減少，膜電位下降。本課題組前期研究[12]表明，MEHP染毒可減少TM-3細胞睪酮的分泌，并引起線粒體損傷，與本研究結(jié)果相互驗證。與中劑量組相比，加入自噬抑制劑后細胞內(nèi)ATP水平和膜電位下降，提示MEHP染毒后誘導(dǎo)TM-3細胞發(fā)生了自噬，且自噬起保護作用。伊夢楠等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MEHP可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，與本研究結(jié)果相互印證。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，MEHP染毒后TM-3細胞的PINK1、P-Parkin、PHB2表達水平升高，Parkin蛋白的表達水平降低，表明TM-3細胞中受損線粒體增多，PINK1無法進入線粒體內(nèi)被降解清除，致使積聚于受損線粒體外膜上的PINK1通過募集游離于細胞質(zhì)中的Parkin至線粒體外膜，從而啟動TM-3細胞線粒體的自噬。高言[11]的研究顯示，氟誘導(dǎo)TM-3細胞線粒體膜電位下降，PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白表達量升高，上述發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果相似。為了檢測PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)的線粒體自噬在MEHP誘導(dǎo)TM-3細胞毒性中起何作用，利用自噬抑制劑3-MA，通過CCK-8法檢測細胞增殖活性來判斷3-MA對MEHP產(chǎn)生的細胞毒性并確定1.0 mmol·L-1的3-MA為后續(xù)實驗濃度。從實驗結(jié)果來看，3-MA干預(yù)后，MEHP對細胞活力的抑制作用增強，PINK1、PParkin、PHB2蛋白表達水平下降，Parkin蛋白的表達水平增高，提示加入3-MA抑制劑后，TM-3細胞線粒體自噬被抑制，MEHP產(chǎn)生的細胞毒性增大。

綜上所述，MEHP可能通過激活PINK1/Parkin信號通路來誘導(dǎo)TM-3細胞線粒體的自噬，為闡明MEHP雄性生殖毒性的分子機制提供了科學(xué)的實驗及理論依據(jù)。