熱暴露對大鼠心臟與肝臟組織細胞凋亡及鐘基因Bmal1的影響

常笑語，朱玲勤，張瀚文，鄧紫薇，陳丹丹，楊春麗，李光華，

（1.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學系，銀川 750004）

熱應激可能造成動物或人生理功能改變[1]，增加心血管系統(tǒng)疾病、腎臟疾病和精神系統(tǒng)疾病的發(fā)生率[2]。當機體處于高溫環(huán)境時，心臟負荷加重，若超過代償能力，會對心臟造成一定程度的損傷[3]。高溫暴露可加劇體內脂質過氧化反應，增加自由基生成，造成心臟和肝臟氧化損傷，且呈現時間依賴性[4]。有實驗[5]表明，熱應激引起肉雞肝臟蛋白質組學的變化，造成了肝臟的明顯損傷。環(huán)境中的溫度信號會對生物的周期性節(jié)律行為產生影響。生物鐘基因是在細胞、組織和生物體水平上調節(jié)生理晝夜節(jié)律所需的基因[6]，廣泛存在于心、腎、肝、脾等組織中。Bmal1是唯一一個單基因敲除即可引起機體晝夜節(jié)律反應完全喪失的核心生物鐘基因[7]。在人體心臟，生物鐘基因有明顯的晝夜節(jié)律性，其中波動最明顯的是Bmal1基因[8]。有大量研究[9-11]顯示，熱應激會促進細胞凋亡，主要包括中樞神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)等的細胞凋亡。一般認為，細胞凋亡發(fā)生異常時，機體發(fā)生疾病的概率就會增加[12]。然而有研究[13]報道，Bmal1可以降低細胞的凋亡水平。本研究旨在探討熱暴露對大鼠心臟與肝臟組織細胞凋亡及鐘基因Bmal1表達水平的影響，為高溫從業(yè)人員（如農業(yè)勞作、消防、軍事和采礦等）的健康防護提供參考和指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用20只健康SD雄性大鼠［合格證號：SCXK（寧）2020-0001］，體質量（180±20）g。隨機分為對照組和熱暴露組，每組10只。實驗前各組大鼠在24℃環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周。對照組和熱暴露組大鼠分別在24℃和32℃環(huán)境中飼養(yǎng)2周進行實驗，飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度均為（55±5）%。所有大鼠每日自由進食飲水，大鼠分籠飼養(yǎng)，勤換墊料，光照明暗周期12 h/12 h。所有動物實驗程序均經寧夏醫(yī)科大學機構評審委員會批準（批準號：NXMU-2020-326）。

1.2 實驗儀器及試劑

人工氣候艙（ZRS JSW，杭州Pnshar Technology Co.Ltd.），智能無創(chuàng)血壓計（Sortron公司）。RNA提取試劑盒（貨號：9767）、逆轉錄試劑（貨號：RR036A）和cDNA合成試劑盒（貨號：RR820A）購自（Takara）寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。蘇木精-伊紅染色試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司；TUNEL試劑盒（貨號：T6013，蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司）；含DAPI封片劑（貨號：S2110，北京索萊寶生物科技有限公司）；一抗：Bmal1（貨號：DF10308-200，美國Affinity Biosciences）；抗β-actin（貨號：TA-09，北京中杉金橋生物技術有限公司）；Bax（貨號：60267-1-lg，武漢三鷹生物技術有限公司）；Bcl-2（貨號：BS1511，南京巴傲德生物科技有限公司）；Caspase3（貨號：ab184787，Abcam生物公司）；二抗：辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（貨號：ZB-2305，北京中杉金橋生物技術有限公司）；Goat Anti-rabbit IgG/HRP（貨號：bs-0259G-HRP，北京博奧森生物技術有限公司）。

1.3 血壓測量

實驗前后分別用智能無創(chuàng)血壓計從SD大鼠尾部測定大鼠的收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）3次，計算血壓平均值并記錄。

1.4 制備石蠟切片及HE染色

實驗后取新鮮大鼠心臟和肝臟，在4%的多聚甲醛液中固定24 h，自來水沖洗2 h，70%乙醇中過夜。次日，從75%乙醇中取組織包埋盒，依次經過80%、90%、95%乙醇2 h、無水乙醇Ⅰ30 min、無水乙醇Ⅱ30 min進行組織脫水。從無水乙醇中取出組織包埋盒，去掉多余乙醇，放入盛有新鮮二甲苯的容器Ⅰ和Ⅱ中各30 min。浸蠟、包埋、切片、脫蠟、脫水、蘇木素溶液中進行細胞核的染色、0.5%分化液（成分：75%乙醇和濃鹽酸）中分化、伊紅染色、滴加中性樹脂，封片，進行后續(xù)拍片觀察。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

提取RNA按照試劑盒說明書，應用熒光分光光度計測定波長為260、280 nm的光密度值，用△△CT法計算RNA的純度和濃度，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實驗-△CT對照，擴增倍數=2-△△CT。將RNA反轉錄為cDNA。反應體系：5×PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）加入4μL，Total RNA加入4μL，RNase Free ddH2O加入12μL，總反應體系20μL。條件如下：37℃、15 min（反轉錄反應），85℃、5 s（反轉錄酶的失活反應）。然后進行qRT-PCR，引物序列見表1，反應體系為：TB Green Premix Ex TaqⅡ［Tli RNaseH Plus（2×）］12.5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，cDNA 2μL，ddH2O 8.5μL。反應條件為：95℃預變性30 s，（95℃變性3 s、60℃退火延伸30 s）×40個循環(huán)，繪制溶解曲線。每份樣本設置3組技術重復，取平均值為CT值，計算各組2－△△CT值并統(tǒng)計各組數據。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 Western blot檢測

蛋白變性后用10%丙烯酰胺十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），上樣量40μg蛋白。將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，后于室溫下將其在5%脫脂牛奶中封閉2 h，然后添加一抗（Bax：1∶5 000，Bcl-2：1∶500，Caspase3：1∶2 000，Bmal1：1∶500，β-actin：1∶3 000）在4℃下孵育，PVDF膜過夜。用TBST（含Tween-20的Tris緩沖鹽水）洗滌3次（10 min/次）后，添加二抗（1∶10 000）并孵育1 h，再用TBST洗滌3次（10 min/次）。用Image J軟件進行條帶灰度值分析。

1.7 TUNEL法檢測組織凋亡

將石蠟切片于60℃蠟箱脫蠟1 h，室溫備用；實驗前再放入蠟箱（2～3 h）；迅速將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min；脫水順序和時間依次為：無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、90%、80%、70%乙醇各5 min；脫水結束后，純水清洗1次，3 min；PBS清洗1次，3 min；滴加100μL Proteinase K，室溫孵育20 min；PBS洗滌2次（5 min/次）。后制陽性片，便于結果比較。每個樣本加入100μL TUNEL平衡緩沖液，孵育5 min；棄去平衡緩沖液，每個樣本再加入50μL TUNEL反應混合液。將樣本平放于濕盒內，37℃避光孵育2 h；去掉反應液，在1×PBS的染色缸中浸泡潤洗2次，每次5 min。再使用適量配制于PBS中的0.1%Triton X-100，其中含5 mg·mL-1BSA的緩沖液清洗樣本3次，每次5 min。封片：將切片樣本先純水浸沒5 min，再放入70%、80%、90%、95%乙醇各5 min，無水乙醇浸沒5 min，最后以新鮮的二甲苯浸泡透明化處理2次，每次5 min。使用抗熒光淬滅封片液封片，去除氣泡使封片完全。后熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，GraphPad Prism 8.0作圖。數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熱暴露對大鼠血壓的影響

實驗結束后，與對照組相比，熱暴露組大鼠的SBP和DBP均升高（P均＜0.01），見圖1。

圖1 熱暴露對大鼠血壓的影響

2.2 熱暴露對大鼠心臟和肝臟組織形態(tài)結構的影響

大鼠心臟HE染色結果顯示：對照組大鼠心肌纖維走向規(guī)則，彈性纖維排列整齊，心肌細胞呈短柱狀，排列整齊，細胞核形似橢圓且長軸與肌原纖維方向一致；熱暴露組大鼠心肌細胞核明顯減小，細胞形態(tài)不清，心肌纖維排列紊亂、斷裂、不規(guī)則。大鼠肝臟HE染色結果顯示：對照組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀規(guī)則排列，細胞核呈圓形，位于細胞的中央，細胞為多角形，規(guī)則完整排列；熱暴露組大鼠肝細胞形態(tài)改變，小葉結構不清晰，排列紊亂，肝細胞形態(tài)改變，不規(guī)則，見圖2。

圖2 熱暴露對大鼠心臟和肝臟組織形態(tài)結構的影響（HE×400）

2.3 TUNEL檢測熱暴露大鼠心臟和肝臟組織凋亡情況

與對照組相比，熱暴露組大鼠心臟組織和肝組織綠色熒光明顯增加，即心肌細胞和肝細胞凋亡細胞增加顯著，見圖3、圖4。

圖3 TUNEL檢測熱暴露大鼠心臟組織凋亡情況

圖4 TUNEL檢測熱暴露大鼠肝臟組織凋亡情況

2.4 qRT-PCR檢測熱暴露大鼠心臟和肝臟Bmal1 mRNA的表達

與對照組比較，熱暴露組大鼠心臟和肝臟組織的Bmal1 mRNA表達均減少（P均＜0.01），見圖5。

圖5 熱暴露大鼠心臟和肝臟組織Bmal1 mRNA的表達

2.5 Western blot檢測熱暴露大鼠心臟及肝臟Bmal1蛋白的表達

與對照組比較，熱暴露組大鼠心臟和肝臟組織Bmal1蛋白表達均減少（P均＜0.05），見圖6。

圖6 熱暴露大鼠心臟和肝臟組織Bmal1蛋白的表達情況

2.6 Western blot檢測熱暴露大鼠心臟和肝臟凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2以及Caspase3的表達

Western blot結果顯示：與對照組相比，熱暴露組大鼠心臟和肝臟組織凋亡相關蛋白Bax和Caspase3表達均上調（P均＜0.01），Bcl-2表達均下調（P均＜0.01），見圖7。

圖7 熱暴露大鼠心臟和肝臟組織凋亡相關蛋白表達情況

3 討論

熱應激直接影響生物的代謝，導致代謝紊亂和活性氧（ROS）積累，并最終導致重要生理過程的損害。有學者[14]認為，熱應激期間，心臟是第一個失效的器官，一旦心臟功能無法正常發(fā)揮，則會直接限制生物的生長、生存及繁殖。熱應激可通過內質網應激和體內外細胞色素C的釋放誘導心肌細胞凋亡，并與多種心血管疾病有關[15]。本研究結果表明，熱暴露可導致低血壓；心臟和肝臟組織在熱暴露后組織結構紊亂，心臟組織肌纖維排列不規(guī)則，甚至有肌纖維斷裂發(fā)生；肝臟組織熱暴露后小葉結構排列紊亂，肝細胞形態(tài)改變。熱應激會引起肝臟細胞凋亡。有研究[16]顯示，熱應激期間，肝臟中與熱休克反應和免疫防御相關的蛋白質和酶的豐度增加，氧化還原狀態(tài)降低，多種抗氧化能力增強，細胞凋亡增加。本實驗中，在熱應激狀態(tài)下，熱暴露組較對照組心臟組織和肝組織綠色熒光明顯增加，表明心肌細胞和肝細胞凋亡細胞增加顯著。Bcl-2蛋白表達降低，Bax和Caspase3蛋白表達升高，表明熱暴露可促進細胞凋亡，損傷心臟和肝臟。

生物鐘系統(tǒng)受一組特殊基因的轉錄/翻譯自動調節(jié)反饋環(huán)調控，稱為生物鐘基因，且機體很多細胞都存在生物鐘基因轉錄因子的自我調節(jié)轉錄/翻譯反饋回路。除下丘腦視上核外，外周細胞也可獨立產生晝夜節(jié)律振蕩，已發(fā)現多種外周組織（如心臟、肝臟等）表達與晝夜節(jié)律相關的基因[17]。由于這種深遠的生理影響，晝夜節(jié)律鐘機制的中斷可能是有害的，并可能導致與肥胖、衰老、哮喘、神經障礙、心臟病發(fā)作和癌癥相關的各種疾病的發(fā)生[18]。有研究[7]顯示，Bmal1作為一種核心的生物鐘基因，能參與多種細胞的凋亡。

Bmal1是一種潛在的抑癌基因，在抑制細胞增殖中具有重要作用。Elshazley等[19]在惡性胸膜間皮瘤的研究中發(fā)現，Bmal1敲低能夠抑制惡性胸膜間皮瘤細胞系的細胞增殖，并促進細胞的凋亡。通過敲減Bmal1表達可促進小鼠睪丸間質細胞的凋亡且伴隨著促凋亡蛋白Bax上調，抑凋亡蛋白Bcl-2下調，表明Bmal1可抑制小鼠睪丸間質細胞凋亡[20]。這與本研究的心臟和肝臟中Bax和Bcl-2的表達一致。在本研究中發(fā)現，熱暴露后SD大鼠的心臟組織和肝臟組織的細胞凋亡水平升高，同時心臟和肝臟組織Bmal1蛋白表達水平減少，提示熱暴露是否通過降低鐘基因Bmal1的表達，從而觸發(fā)細胞凋亡的發(fā)生。課題組前期的研究[21]也表明干擾Bmal1的表達會提高細胞的凋亡水平。

本實驗探究了熱暴露對大鼠心臟和肝臟組織凋亡的影響及熱暴露對鐘基因Bmal1表達水平的改變。結果表明，在SD大鼠心臟和肝臟組織中，熱暴露誘導SD大鼠心臟和肝臟組織細胞發(fā)生凋亡，Bmal1蛋白表達水平降低，提示熱暴露促進細胞凋亡的發(fā)生可能與鐘基因Bmal1蛋白表達下調有關。具體的機制需要后續(xù)實驗進一步探討。