DNAJB6b通過激活A(yù)KT通路增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力

陳丁雄，朱依青，史建紅，蔡 巖，郝佳潔，王明榮，梁建偉，張 鈺，*

(1．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，結(jié)直腸外科，北京 100021)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是影響人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位居我國惡性腫瘤的第3位和第5位[1]。早期CRC 患者的5年生存率可達(dá)90%，但中晚期患者的5 年生存率不足20%[2]。在我國，約60%的CRC 患者確診時已為中晚期，盡管治療方法和手段不斷改善，但晚期患者的5年生存率仍一直徘徊在10%左右[3-4]。目前CRC的病因尚不明確，亟待進(jìn)一步研究闡明其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理，為研發(fā)更多有效的靶向藥物提供理論依據(jù)。

DnaJ 熱休克家族成員B6(DnaJ heat shock protein family member B6，DNAJB6)屬于DnaJ熱休克蛋白家族(Hsp40)B 亞族成員，又稱DnaJ 的哺乳動物親屬(mammalian relative of DnaJ，MRJ)。DNAJB6基因定位于染色體7q36.3，可剪接形成3 個轉(zhuǎn)錄本，編碼產(chǎn)生DNAJB6a、DNAJB6b 和DNAJB6d 共3 種蛋白異構(gòu)體。DNAJB6作為輔助伴侶分子，可參與底物蛋白的正確折疊及轉(zhuǎn)運(yùn)，阻止蛋白質(zhì)異常聚集，調(diào)控蛋白降解及重塑等過程[5]。既往研究顯示DNAJB6功能失調(diào)不僅與多種疾病相關(guān)，在腫瘤發(fā)生進(jìn)展過程中也發(fā)揮重要作用[6-9]。值得注意的是，DNAJB6的a和b兩個異構(gòu)體的功能存在明顯差異。有研究提示DNAJB6a可發(fā)揮抑癌作用，而DNAJB6b 發(fā)揮促癌作用[10-14]。而且，上述兩個異構(gòu)體的表達(dá)具有明顯的組織特異性，在不同類型的腫瘤中變化趨勢也有所不同[9-10]。目前，在腫瘤中的研究多集中于DNAJB6a，DNAJB6b的作用還鮮有報道。

我們在前期研究中通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)分析發(fā)現(xiàn)，DNAJB6 在CRC 組織中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)是CRC患者預(yù)后不良的一個獨(dú)立預(yù)測因素。同時，功能研究提示DNAJB6 過表達(dá)可以顯著增強(qiáng)CRC 細(xì)胞的侵襲遷移能力[9]。由于相關(guān)研究提示DNAJB6的異構(gòu)體a和b在表達(dá)和功能上存在較大差異，這兩個異構(gòu)體在CRC中的表達(dá)變化和功能作用尚需進(jìn)行深入研究。

在本研究中，我們首先對CRC 組織中DNAJB6 的異構(gòu)體a 和b 的表達(dá)改變進(jìn)行分析，并根據(jù)分析結(jié)果，使用基因表達(dá)敲降、Western blot檢測、Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)及挽救實(shí)驗(yàn)，探討了CRC組織中異常表達(dá)的DNAJB6 異構(gòu)體對CRC 細(xì)胞侵襲運(yùn)動能力的影響及其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、RPMI 1640 和IMDM 購自北京細(xì)工生物，胎牛血清購自Newzerum 公司，SDSPAGE 凝膠配制試劑盒購自碧云天生物，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，BCA蛋白定量試劑盒、Opti-MEM 培養(yǎng)基、嘌呤霉素和ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自Thermo Scientific 公司。AKT 和p-AKT(Ser473)抗體購自CST 公司，HA 標(biāo)簽抗體購自MBL 公司、DNAJB6 和GAPDH 抗體購自Proteintech公司。DMSO購自Sigma公司，BEZ235購自Selleck 公司，Matrigel 和Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室購自Corning 公司。電泳儀購自Bio-Rad 公司，酶標(biāo)儀購自BioTek Instrument公司，倒置光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus公司，低溫臺式高速離心機(jī)和二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific 公司，化學(xué)發(fā)光成像儀購自Beckman，數(shù)字切片掃描儀購自Hamamatsu公司。

1.2 方法

1.2.1 CRC 腫瘤組織和正常組織mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)的獲取在NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE32323的表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)和探針平臺矩陣數(shù)據(jù)，從中選取17對配對的CRC 腫瘤和癌旁正常組織的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。利用探針平臺矩陣，獲取DNAJB6a、DNAJB6b對應(yīng)的探針209015_s_at 和208810_at。結(jié)合探針矩陣和表達(dá)矩陣，得到DNAJB6 的兩個轉(zhuǎn)錄本DNAJB6a 和DNAJB6b mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胚胎腎細(xì)胞293FT、CRC 細(xì)胞系DLD-1 和HCT116 購自南京科佰生物，分別使用添加10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(0.1 mg/mL)的DMEM、RPMI 1640和IMDM培養(yǎng)基，于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均經(jīng)短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定無誤。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染DNAJB6b特異性的siRNA的靶序列 為：siDNAJB6b-T1，5′-GCACGCACTTAACAGAA AT-3′；siDNAJB6b-T2，5′-GCTCATCGGAGCCTCTA TT-3′。陰性對照siRNA 的靶序列為：5′-TTCTCCGA ACGTGTCACGT- 3′ 。 使 用Opti- MEM 培 養(yǎng) 基 和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染siRNA至CRC細(xì)胞，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞沉淀進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.4 構(gòu)建穩(wěn)定敲降DNAJB6b 表達(dá)的CRC 細(xì)胞株pLKO.1-shDNAJB6b-puro 和pLKO.1-陰性對照shRNA質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。shDNAJB6b的靶序列與siDNAJB6b-T1 一致，陰性對照shRNA 的靶序列與陰性對照siRNA一致。在293FT細(xì)胞中，使用Opti-MEM培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染可表達(dá)DNAJB6b shRNA(簡稱shDNAJB6b)或陰性對照shRNA 的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和病毒包裝質(zhì)粒，收集病毒上清感染DLD-1 和HCT116 細(xì)胞，使用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，用于后續(xù)的Western blot分析和挽救實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 抑制劑處理在CRC 細(xì)胞系DLD-1和HCT116中，使用20 nmol/L的PI3K-mTOR雙重抑制劑BEZ235處理細(xì)胞，以溶劑DMSO 處理細(xì)胞作為對照。處理24 h后，將各組細(xì)胞接種至Transwell上室進(jìn)行侵襲遷移實(shí)驗(yàn)，上室中的培養(yǎng)基仍含有相應(yīng)的藥物。

1.2.6 挽救實(shí)驗(yàn)在穩(wěn)定敲降DNAJB6b 的DLD-1 和HCT116 細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染組成型活化的myr-AKT 質(zhì)粒和空載質(zhì)粒(方法同siRNA 轉(zhuǎn)染)，陰性對照shRNA組僅轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒，收集各組細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測和Transwell實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 Western blot檢測使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液提取分離經(jīng)上述各種實(shí)驗(yàn)處理細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，按常規(guī)方法進(jìn)行PAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，與AKT、p-AKT(Ser473)、DNAJB6及HA-tag抗體進(jìn)行雜交并使用ECL 檢測試劑顯示雜交信號，以GAPDH 作為內(nèi)參對照。

1.2.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)分為侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel 基質(zhì)膠稀釋后鋪于Transwell 小室上室，下室加入含20%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基。在上室中接種1.5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后固定染色，統(tǒng)計穿膜細(xì)胞數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn)：無需提前在Transwell上室鋪Matrigel 基質(zhì)膠，細(xì)胞培養(yǎng)時間為36 h，其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)一致。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行圖表制作。使用配對樣本t檢驗(yàn)分析CRC 腫瘤組織和癌旁正常組織中DNAJB6 不同轉(zhuǎn)錄本mRNA 表達(dá)水平的差異；使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析BEZ235 處理組和DMSO對照組CRC細(xì)胞侵襲遷移能力的差異；使用單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析挽救實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞間侵襲遷移能力的差異，在方差齊性的前提下，使用Turkey-HSD 法進(jìn)行組間比較。當(dāng)P＜0.05 時，為組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNAJB6 不同轉(zhuǎn)錄本在結(jié)直腸癌組織中的mRNA表達(dá)水平存在差異

從NCBI 的GEO 公共數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE32323的表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)和探針平臺矩陣數(shù)據(jù)，選取17例手術(shù)切除的配對正常及腫瘤組織，提取DNAJB6a(209015_s_at探針)和DNAJB6b(208810_at探針)的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，DNAJB6a在CRC組織中的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.458，圖1A)，而DNAJB6b在CRC 組織中的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05，圖1B)。

圖1 CRC組織中DNAJB6不同轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達(dá)變化情況

2.2 DNAJB6b正向調(diào)控AKT的活性

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，敲降DNAJB6 表達(dá)可以顯著降低CRC 細(xì)胞的侵襲遷移能力[9]。由于有研究顯示AKT通路異?；罨贑RC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[15-16]，而且我們也發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT-mTOR信號通路在CRC組織中過度活化并與患者的不良預(yù)后顯著正相關(guān)[17]，因此在本研究中我們探討了AKT 異?；罨贒NAJB6b介導(dǎo)的CRC細(xì)胞侵襲遷移表型中的作用。首先，我們檢測了DNAJB6b表達(dá)水平對AKT活性的影響。我們在DNAJB6b 高表達(dá)的兩個CRC 細(xì)胞系DLD-1 和HCT116 中，使用兩個獨(dú)立的siRNA 特異性敲降DNAJB6b 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)瞬時敲降DNAJB6b 的表達(dá)可使細(xì)胞中p-AKT(Ser473)的水平明顯降低(圖2A、B)。類似地，我們使用慢病毒感染DLD-1 和HCT116細(xì)胞，通過病毒載體表達(dá)的shRNA穩(wěn)定敲降DNAJB6b的表達(dá)，同樣可以觀察到細(xì)胞中p-AKT(Ser473)水平的明顯下調(diào)(圖2C、D)。

圖2 敲降DNAJB6b表達(dá)后下調(diào)p-AKT的蛋白表達(dá)水平

2.3 AKT 通路活化增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力

為證實(shí)AKT 信號通路活化在CRC 細(xì)胞系DLD-1和HCT116中對侵襲遷移能力的影響，我們使用PI3KmTOR 雙重抑制劑BEZ235 處理這兩個細(xì)胞并進(jìn)行Transwell 侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)。分析結(jié)果顯示，使用BEZ235 處理抑制AKT 通路的活性可導(dǎo)致細(xì)胞侵襲遷移能力顯著降低(均為P＜0.01，圖3)。

圖3 抑制AKT通路活性可降低CRC細(xì)胞的侵襲遷移能力

2.4 DNAJB6b 可通過激活A(yù)KT 通路增強(qiáng)CRC 細(xì)胞的侵襲遷移能力

為進(jìn)一步證實(shí)AKT通路過度活化是否在DNAJB6b介導(dǎo)的侵襲遷移表型中發(fā)揮重要作用，我們進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。分析結(jié)果顯示，在穩(wěn)定敲降DNAJB6b 的DLD-1 和HCT116 細(xì)胞中，通過外源過表達(dá)組成型活化的AKT(myr-AKT)上調(diào)p-AKT(Ser473)的水平(圖4)，可以顯著回復(fù)由于敲降DNAJB6b表達(dá)所致的細(xì)胞侵襲遷移能力降低(圖5)。

圖4 在DNAJB6b 穩(wěn)定敲降及外源myr-AKT 過表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

圖5 過表達(dá)myr-AKT可逆轉(zhuǎn)DNAJB6b敲降導(dǎo)致的CRC細(xì)胞侵襲遷移能力降低

3 討 論

CRC 中DNAJB6 異構(gòu)體的作用尚未見文獻(xiàn)報道。在本研究中，我們分析發(fā)現(xiàn)，與正常癌旁組織相比，CRC組織中DNAJB6的異構(gòu)體DNAJB6b mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而DNAJB6a mRNA 的表達(dá)無顯著改變。而且，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DNAJB6b高表達(dá)可通過激活A(yù)KT通路的活性增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲遷移能力，提示DNAJB6b異常過表達(dá)可能在CRC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

以往的研究顯示，DNAJB6 在不同類型的腫瘤組織中表達(dá)變化趨勢不同。例如免疫組織化學(xué)(IHC)分析結(jié)果顯示在食管癌、乳腺癌組織中DNAJB6 表達(dá)下降，而在肺癌和結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平升高[9，14，18-21]。然而由于現(xiàn)有商售抗體不能對DNAJB6 的不同異構(gòu)體加以區(qū)分，IHC 分析實(shí)際上無法反映單個異構(gòu)體的表達(dá)改變。近期，有研究報道，在食管鱗癌中DNAJB6a mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)并發(fā)揮抑癌作用，而DNAJB6b mRNA的表達(dá)水平無顯著變化[10]。盡管我們的IHC 分析結(jié)果顯示DNAJB6 在CRC 組織中表達(dá)上調(diào)，但Western blot 分析結(jié)果顯示DNAJB6 的異構(gòu)體a和b 在CRC 組織中的表達(dá)豐度存在明顯差異[9]。不僅癌組織中DNAJB6b的表達(dá)水平明顯高于正常組織，而且DNAJB6b 的表達(dá)豐度也遠(yuǎn)高于DNAJB6a，提示DNAJB6b可能是在CRC細(xì)胞中發(fā)揮功能作用的優(yōu)勢異構(gòu)體。為驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，在本研究中我們對GEO數(shù)據(jù)庫中的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DNAJB6b mRNA 在CRC 組織中表達(dá)顯著上調(diào)，而DNAJB6a mRNA 的表達(dá)并無明顯改變。而且，使用siRNA 和shRNA特異性地敲降CRC細(xì)胞中DNAJB6b的表達(dá)，可以顯著抑制CRC 細(xì)胞的侵襲遷移能力。上述結(jié)果表明，DNAJB6b 而非DNAJB6a 在CRC 組織中表達(dá)上調(diào)，同時提示DNAJB6b過表達(dá)在CRC細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用。

為進(jìn)一步分析DNAJB6b過表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞侵襲遷移的分子機(jī)制，我們分析了相關(guān)信號通路的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)p-AKT(Ser437)的表達(dá)水平在DNAJB6b 敲降細(xì)胞中明顯降低。PI3K/AKT信號通路異?；罨诙喾N惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。既往有大量文獻(xiàn)報道，PI3K/AKT 信號通路的活化與CRC 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-16]。在本研究中，我們使用PI3K/mTOR 通路雙重抑制劑BEZ235 處理DLD-1 和HCT116細(xì)胞，證實(shí)AKT通路的活化確實(shí)可以增強(qiáng)這兩個CRC細(xì)胞系的侵襲遷移能力。進(jìn)而，我們通過挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AKT的激活在DNAJB6b過表達(dá)介導(dǎo)的CRC細(xì)胞侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示DNAJB6b異常過表達(dá)在CRC細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用，而且DNAJB6b可通過正向調(diào)控AKT的活性增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲遷移能力。同時，本研究結(jié)果提示，DNAJB6b可能作為潛在的分子靶點(diǎn)，用于CRC，特別是轉(zhuǎn)移性CRC 的治療。目前，DNAJB6b調(diào)控AKT活性的具體分子機(jī)制還未闡明，也未見到有關(guān)DNAJB6b特異性抑制劑的報道。后續(xù)的研究一方面將深入探索揭示DNAJB6b促癌作用的分子機(jī)制，同時需要篩選鑒定DNAJB6b的靶向抑制劑并探索聯(lián)合靶向治療策略。