線粒體靶向抗氧化劑Mito-TEMPO對(duì)氮芥誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞損傷的影響

趙晨茜，徐安琦，2，艾 多，2，孔德欽，張曉迪，李文麗，海春旭，劉江正，*

（1．空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032；2．空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員二大隊(duì)，陜西 西安 710032)

糜爛性毒劑是一類重要的化學(xué)戰(zhàn)劑，在歷史上曾被大量使用，造成了大量人員傷亡[1]。糜爛性毒劑作為日遺化武的主要成分和重要的化學(xué)恐怖劑，對(duì)我國(guó)人民的安全構(gòu)成了嚴(yán)重而持久的威脅[2]。肺是糜爛性毒劑中毒的主要靶器官之一，戰(zhàn)場(chǎng)條件下大劑量吸入這類毒劑蒸氣能夠?qū)е录毙苑螕p傷，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，目前還缺乏有效的治療藥物[3]。氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和線粒體功能障礙被認(rèn)為是糜爛性毒劑導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)損傷的關(guān)鍵毒作用機(jī)制[4]。氮芥(nitrogen mustard，HN2)是經(jīng)典的糜爛性毒劑之一，也是芥子氣的重要模擬劑，主要通過(guò)呼吸道和皮膚暴露，吸收后可以導(dǎo)致全身中毒[5]。HN2 常用來(lái)構(gòu)建糜爛性毒劑中毒動(dòng)物模型，以研究其中毒機(jī)制和防治策略[6]。

Mito-TEMPO 是一種具有線粒體靶向功能的超氧化物歧化酶模擬物，在線粒體局部具有較強(qiáng)的清除超氧化物和超氧陰離子自由基的能力，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1 所示[7]。大量研究表明，Mito-TEMPO 被證實(shí)在多種損傷模型中能夠減輕氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞死亡[8-9]，同時(shí)還具有一定抗腫瘤作用[7]。Mito-TEMPO在糜爛性毒劑誘導(dǎo)的急性肺損傷中是否具有保護(hù)作用尚不清楚。本研究通過(guò)HN2染毒構(gòu)建糜爛性毒劑誘導(dǎo)肺損傷體外模型，旨在明確Mito-TEMPO 干預(yù)對(duì)HN2 誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞毒性的作用，并初步探討其作用機(jī)制，為糜爛性毒劑中毒導(dǎo)致的急性肺損傷的救治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 Mito-TEMPO的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

BEAS-2B細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑Mito-TEMPO 購(gòu)自中國(guó)MedChem Express(MCE)生物試劑有限公司；鹽酸HN2(純度99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PBS、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自上海吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、Annexin V/PI 雙染凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；MitoSOX、DCFH-DA、DHE探針購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；ATP 含量檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)索萊寶生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 一步法RT-PCR 試劑盒購(gòu)自中國(guó)AG 生物科技有限公司。其他所用化學(xué)品均為分析純以上級(jí)別。

1.2.2 主要儀器流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD 公司產(chǎn)品；SCIENTZ-48 高通量組織研磨器為寧波新芝公司產(chǎn)品；全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；Infinite M200 Pro 全波段酶標(biāo)儀購(gòu)于瑞士Tecan 公司；NanoDrop 2000分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.3 方 法

1.3.1 細(xì)胞處理和實(shí)驗(yàn)分組BEAS-2B 細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿70%~80%瓶底面積時(shí)，使用含0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代或接種。Mito-TEMPO溶于DMSO中，配制為100 mmol/L儲(chǔ)備液。鹽酸氮芥直接溶解于RPMI-1640 培養(yǎng)基中，現(xiàn)用現(xiàn)配。Mito-TEMPO 干預(yù)HN2 導(dǎo)致細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)中，分為正常對(duì)照組、Mito-TEMPO 對(duì)照組、HN2染毒組和Mito-TEMPO干預(yù)組(見(jiàn)圖2)，其中正常對(duì)照組給予含DMSO(體積分?jǐn)?shù)為0.1%)的無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)基處理26 h；Mito-TEMPO 對(duì)照組給予Mito-TEMPO(100 μmol/L)處理26 h；HN2染毒組首先給予含DMSO(體積分?jǐn)?shù)為0.1%)的無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)基預(yù)處理2 h，然后給予HN2(8 μmol/L)染毒24 h；Mito-TEMPO干預(yù)組細(xì)胞給予Mito-TEMPO(100 μmol/L)預(yù)處理2 h，然后HN2(8 μmol/L)和Mito-TEMPO(100 μmol/L)進(jìn)行共處理24 h。

圖2 實(shí)驗(yàn)分組及方案示意圖

1.3.2 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活性將BEAS-2B 細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度后，進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)處理。處理結(jié)束后，使用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基將CCK-8 原液稀釋10 倍，每孔加入CCK-8 使用液100 μL，37 ℃孵箱避光孵育0.5 h，然后用全波段酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度值D(450)，該吸光度值可間接反映細(xì)胞活性變化。

1.3.3 速率法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清LDH 活性使用商品化乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清LDH活性：處理結(jié)束后，小心分離細(xì)胞培養(yǎng)基，1 000 g離心5 min，取上清，立即按照說(shuō)明書步驟檢測(cè)LDH活性。

1.3.4 Annexin V/PI 探針?lè)魇郊?xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將BEAS-2B 細(xì)胞接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后，胰酶消化細(xì)胞，按照Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)FL-1 通道和FL-3 通道熒光強(qiáng)度。使用儀器自帶CFlowPlus軟件分析和處理數(shù)據(jù)。

1.3.5 熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和線粒體膜電位將BEAS-2B 細(xì)胞接種于6 孔板，處理結(jié)束后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，各孔加入終濃度為10 μg/mL 的MitoSOX、10 μmol/L 的DCFH-DA、10 μmol/L 的DHE、10 μmol/L的JC-1探針染料，37 ℃孵箱中避光孵育20 min，然后胰酶消化后離心，棄去上清后PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)通道熒光強(qiáng)度，每樣分別計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。MitoSOX檢測(cè)線粒體ROS，DHE檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總ROS，二者均計(jì)算紅色熒光強(qiáng)度曲線下面積；DCFH-DA 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2，計(jì)算綠色熒光強(qiáng)度曲線下面積；JC-1探針檢測(cè)線粒體膜電位時(shí)，計(jì)算紅色熒光強(qiáng)度曲線下面積與綠色熒光強(qiáng)度曲線下面積之比。使用儀器自帶CFlowPlus 軟件分析和處理數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.6 紫外分光光度法檢測(cè)細(xì)胞勻漿ATP 含量將BEAS-2B細(xì)胞接種于15 cm培養(yǎng)皿，按1.3.1的實(shí)驗(yàn)方案處理結(jié)束后，胰酶消化細(xì)胞，反復(fù)凍融5 次后，玻璃勻漿器制備細(xì)胞勻漿。BAC蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞勻漿蛋白濃度，使用商品化ATP含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞勻漿ATP水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，紫外分光光度法檢測(cè)終末產(chǎn)物吸光值，ATP 單位為nmol/mg。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)水平使用商品化通用型RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，并使用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)分析RNA 的濃度和純度。鑒定純度及濃度合格后，使用cDNA 合成超級(jí)混合試劑盒對(duì)提取的總RNA(2 μg)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件如下：42 ℃、60 min，然后70 ℃、5 min。使用QuantStudio 7 Flex 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)和SYBR Green PCR master Mix 快速擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，循環(huán)條件為95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s。mRNA 的相對(duì)定量值使用比較-Ct 法(ΔΔCt 法)。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)中所使用引物的序列信息見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，使用GraphPad Prism 8.0軟件統(tǒng)計(jì)和分析數(shù)據(jù)，Tukey多重比較檢驗(yàn)用于比較正常對(duì)照組和HN2 染毒組之間、HN2 染毒組和Mito-TEMPO 干預(yù)組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05被認(rèn)為具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響

首先，我們觀察了Mito-TEMPO 單獨(dú)干預(yù)對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞活性的影響。CCK-8 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3A，與未染毒細(xì)胞相比，25~400 μmol/L 的Mito-TEMPO 單獨(dú)處理24 h 的細(xì)胞活性無(wú)明顯改變(P＞0.05)，而800 μmol/L的Mito-TEMPO處理24 h的細(xì)胞活性降低了約16.4%(P＜0.05)。結(jié)合以往的文獻(xiàn)，我們選擇了100 μmol/L 作為Mito-TEMPO 的藥物干預(yù)濃度。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇了8 μmol/L的HN2暴露24 h 構(gòu)建體外損傷模型。如圖3B 所示，與正常對(duì)照組相比，HN2染毒組的細(xì)胞活性降低了約19.2%(P＜0.05)。與HN2 染毒組相比，Mito-TEMPO 干預(yù)組細(xì)胞活性下降了約42.6%(P＜0.05，圖3B)。培養(yǎng)液上清LDH活性結(jié)果見(jiàn)圖3C，單獨(dú)Mito-TEMPO 處理對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清LDH 活性無(wú)顯著影響(P＞0.05)，與HN2 染毒組相比，Mito-TEMPO 干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)基上清LDH活性顯著增加(P＜0.05)，進(jìn)一步證實(shí)100 μmol/L 的Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)細(xì)胞毒性具有促進(jìn)作用。

圖3 Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響(n=8)

倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見(jiàn)圖4，Mito-TEMPO 單獨(dú)干預(yù)細(xì)胞形態(tài)基本正常，但HN2 暴露后細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且部分細(xì)胞呈現(xiàn)梭狀，Mito-TEMPO 干預(yù)后呈現(xiàn)皺縮狀態(tài)的死細(xì)胞數(shù)量明顯增多。以上結(jié)果表明，100 μmol/L 的Mito-TEMPO 干預(yù)對(duì)HN2導(dǎo)致細(xì)胞損傷具有一定程度的促進(jìn)作用。

圖4 倒置顯微鏡下觀察Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)改變的影響(×40)

2.2 Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V/PI 探針?lè)z測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果見(jiàn)圖5，與正常對(duì)照組相比，Mito-TEMPO單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響(P＞0.05)，HN2 染毒組的細(xì)胞凋亡率約為43.2%，與正常對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05)，Mito-TEMPO干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率約為51.4%，與HN2染毒組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖5 AnnexinV/PI雙熒光探針?lè)z測(cè)Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

2.3 Mito-TEMPO 干預(yù)對(duì)HN2 誘導(dǎo)線粒體功能障礙的影響

JC-1 探針?lè)z測(cè)線粒體膜電位結(jié)果見(jiàn)圖6A 和B，與正常對(duì)照組相比，Mito-TEMPO 單獨(dú)處理對(duì)線粒體膜電位水平無(wú)顯著影響(P＞0.05)，8 μmol/L HN2 暴露24 h 后細(xì)胞線粒體膜電位水平顯著降低(P＜0.05)，100 μmol/L Mito-TEMPO 干預(yù)既未改善，也未惡化HN2 導(dǎo)致的細(xì)胞膜電位下降(P＞0.05)。細(xì)胞勻漿ATP含量檢測(cè)結(jié)果如圖6C所示，100 μmol/L Mito-TEMPO單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，HN2染毒后細(xì)胞內(nèi)ATP 含量顯著降低(P＜0.05)。與HN2 染毒組相比，Mito-TEMPO 干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)ATP 含量無(wú)顯著改變(P＞0.05，圖6C)。

圖6 Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)線粒體功能障礙的影響

2.4 Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響

RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平的結(jié)果見(jiàn)圖7，與正常對(duì)照組相比，Mito-TEMPO 對(duì)照組TNF-α和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平無(wú)顯著改變(P＞0.05)，HN2 暴露組上述分子的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。與HN2 染毒組相比，Mito-TEMPO 干預(yù)組細(xì)胞的TNF-α和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

圖7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平

2.5 Mito-TEMPO 干預(yù)對(duì)HN2 誘導(dǎo)線粒體ROS、H2O2及總ROS的影響

MitoSOX 熒光探針檢測(cè)線粒體ROS 水平的結(jié)果見(jiàn)圖8A，與正常對(duì)照組相比，Mito-TEMPO 單獨(dú)處理顯著降低了線粒體ROS 水平(P＜0.05)，而HN2 染毒導(dǎo)致線粒體ROS 水平顯著升高(P＜0.05)，與HN2 染毒組相比，Mito-TEMPO 干預(yù)組細(xì)胞線粒體ROS 水平降低了53.6%(P＜0.05)。DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2水平的結(jié)果見(jiàn)圖8B，與正常對(duì)照組相比，Mito-TEMPO 單獨(dú)處理和HN2 染毒均顯著升高了細(xì)胞內(nèi)H2O2水平(P＜0.05)，與HN2 染毒組相比，Mito-TEMPO干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)H2O2水平增加了171%(P＜0.05)。DHE熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總ROS水平的結(jié)果見(jiàn)圖8C，與正常對(duì)照組相比，HN2 染毒組細(xì)胞總ROS 水平升高了約47.2%(P＜0.05)，與HN2 染毒組相比，Mito-TEMPO 干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)總ROS水平升高了約43.4%(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，雖然Mito-TEMPO 能夠顯著抑制HN2 導(dǎo)致的線粒體ROS水平的升高，但反而促進(jìn)了HN2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)H2O2和總ROS水平的升高。

圖8 Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)線粒體ROS、H2O2及總ROS改變的影響(n=3)

3 討 論

在戰(zhàn)場(chǎng)條件下或化學(xué)恐怖襲擊過(guò)程中，通過(guò)呼吸道大量暴露糜爛性毒劑可引起嚴(yán)重的急性肺損傷，目前其機(jī)制尚不明確，且缺乏有效的干預(yù)手段[3]。Mito-TEMPO作為一種新型線粒體超氧陰離子清除劑，已被證明在多種氧化應(yīng)激損傷模型中具有較好的保護(hù)作用[10-11]。然而，Mito-TEMPO在糜爛性毒劑誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷中的作用尚不清楚。在本研究中，我們通過(guò)細(xì)胞染毒HN2 構(gòu)建了體外模型，以明確Mito-TEMPO是否可以減輕糜爛性毒劑誘導(dǎo)上皮細(xì)胞損傷并探討其相關(guān)機(jī)制。這是首次在體外細(xì)胞水平上較為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)線粒體靶向的超氧化物歧化酶模擬劑Mito-TEMPO對(duì)糜爛性毒劑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，安全劑量的Mito-TEMPO 干預(yù)并未有效減輕HN2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，反而一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞損傷。

我們首先篩選了有效的Mito-TEMPO 干預(yù)濃度。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)除了800 μmol/L濃度造成細(xì)胞活性輕微損傷外，400 μmol/L 以下濃度的Mito-TEMPO均是安全的，未造成明顯的細(xì)胞毒性。結(jié)合文獻(xiàn)[12]報(bào)道，后續(xù)研究我們選擇了100 μmol/L 濃度的Mito-TEMPO 進(jìn)行體外干預(yù)研究，該濃度在多種模型中被證實(shí)具有良好的抗氧化保護(hù)效應(yīng)[13-14]。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性，我們意外發(fā)現(xiàn)Mito-TEMPO干預(yù)后并未發(fā)揮保護(hù)作用，反而顯著加重了HN2 誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞活性損傷。細(xì)胞損傷后會(huì)釋放LDH，培養(yǎng)基上清LDH 活性是評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的敏感指標(biāo)[15]。LDH 檢測(cè)結(jié)果與CCK-8 結(jié)果類似，進(jìn)一步證實(shí)Mito-TEMPO 干預(yù)在HN2 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性模型中發(fā)揮了促損傷作用。顯微鏡下觀察細(xì)胞大體形態(tài)，也證實(shí)了上述結(jié)果。通過(guò)上述多種途徑的交叉驗(yàn)證，我們證實(shí)100 μmol/L的Mito-TEMPO 與8 μmol/L的HN2共處理能夠通過(guò)某種途徑增強(qiáng)HN2的細(xì)胞毒性。

凋亡被認(rèn)為是糜爛性毒劑導(dǎo)致肺損傷的重要中毒機(jī)制之一[16]。以往的研究表明，HN2 氣管內(nèi)暴露后能夠?qū)е路闻萆掀ぜ?xì)胞發(fā)生顯著凋亡[17]。有學(xué)者研究報(bào)道稱，Mito-TEMPO 在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，會(huì)引起一定的繼發(fā)性肝細(xì)胞凋亡[18]。為了闡明凋亡是否參與了Mito-TEMPO 的促HN2 損傷效應(yīng)，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了凋亡細(xì)胞比例的改變，結(jié)果證實(shí)HN2 暴露能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而Mito-TEMPO 處理既未促進(jìn)凋亡，也未抑制凋亡，提示100 μmol/L 的Mito-TEMPO 促HN2誘導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)可能獨(dú)立于凋亡作用。大量的研究證實(shí)，線粒體功能障礙在糜爛性毒劑誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，其原因可能是通過(guò)烷化線粒體的DNA 和脂質(zhì)，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)導(dǎo)致電子傳遞鏈功能異常，“電子漏”增加，同時(shí)也參與了氧化應(yīng)激的發(fā)生和發(fā)展[19]。線粒體內(nèi)主要的ROS 類型是超氧陰離子自由基，也是Mito-TEMPO作用的主要底物[9]。本研究證實(shí)HN2 暴露后導(dǎo)致BEAS-2B 細(xì)胞發(fā)生顯著的線粒體功能障礙，表現(xiàn)為線粒體膜電位降低和ATP合成能力下降，但100 μmol/L 的Mito-TEMPO 干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)線粒體功能異常既無(wú)改善，也無(wú)促進(jìn)作用。糜爛性毒劑呼吸道中毒往往會(huì)導(dǎo)致肺部不可控的炎癥反應(yīng)[20]。HN2暴露不僅會(huì)導(dǎo)致肺泡灌洗液中的蛋白和炎癥細(xì)胞顯著增加[8]，還能引起細(xì)支氣管周圍區(qū)域、肺泡腔、血管和肺血管周圍間質(zhì)中性粒細(xì)胞明顯聚集[9]。我們?cè)隗w外模型中發(fā)現(xiàn)，HN2暴露后顯著上調(diào)了上皮細(xì)胞中TNF-α和IL-6的mRNA水平，與以往報(bào)道的結(jié)論相一致[20]。以往的體內(nèi)研究表明，Mito-TEMPO可以通過(guò)減輕炎癥和線粒體功能障礙，緩解腎纖維化[21]，但在HN2 體外模型中，Mito-TEMPO 干預(yù)對(duì)炎癥和線粒體功能反應(yīng)均無(wú)顯著影響，其機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

值得注意的是，我們的研究發(fā)現(xiàn)100 μmol/L 的Mito-TEMPO 雖然顯著抑制了由HN2 染毒引起的線粒體ROS生成增加，但同時(shí)也明顯促進(jìn)了HN2導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)H2O2和總ROS的過(guò)量生成。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)镸ito-TEMPO 可以選擇性地在線粒體中積累，主要發(fā)揮線粒體局部調(diào)控作用，通過(guò)高效的催化線粒體超氧陰離子生成大量H2O2[7]。大量文獻(xiàn)表明，過(guò)量的超氧陰離子雖然能夠?qū)е卵趸瘧?yīng)激損傷，但適度水平可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能方面發(fā)揮了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要功 能[22]。大量的消耗線粒體ROS雖然可以減少線粒體局部氧化應(yīng)激，但在細(xì)胞整體水平上可能會(huì)導(dǎo)致線粒體ROS信號(hào)傳導(dǎo)功能的喪失。此外，由于Mito-TEMPO 干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)H2O2水平和總ROS水平顯著升高，我們推測(cè)其原因可能是Mito-TEMPO 催化生成了大量H2O2，超出了細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶清除H2O2的能力，進(jìn)而導(dǎo)致了大量H2O2蓄積，進(jìn)而通過(guò)芬頓式反應(yīng)等生成大量羥自由基等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS不可控的累積，最終導(dǎo)致HN2染毒細(xì)胞處于高水平的氧化應(yīng)激狀態(tài)并發(fā)生細(xì)胞損傷。大量研究已經(jīng)證實(shí)，糜爛性毒劑暴露會(huì)通過(guò)線粒體氧化應(yīng)激導(dǎo)致明顯的線粒體結(jié)構(gòu)異常和功能障礙[19，23]。雖然通過(guò)細(xì)胞毒性測(cè)試，我們證實(shí)100 μmol/L 的Mito-TEMPO 干預(yù)增加了HN2 導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，但后續(xù)的實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明Mito-TEMPO 并未促進(jìn)HN2 相關(guān)的細(xì)胞凋亡發(fā)生和線粒體功能障礙。我們推測(cè)，雖然HN2 和Mito-TEMPO共處理通過(guò)提高總ROS水平誘導(dǎo)細(xì)胞整體水平的氧化應(yīng)激損傷，但Mito-TEMPO 干預(yù)可能通過(guò)線粒體局部的高效抗氧化作用，有效拮抗HN2誘導(dǎo)過(guò)量ROS生成對(duì)線粒體的攻擊，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙和凋亡未出現(xiàn)明顯改變。Mito-TEMPO 的促HN2 損傷效應(yīng)可能是通過(guò)獨(dú)立于凋亡和線粒體損傷作用發(fā)生的，主要通過(guò)損傷其他細(xì)胞器和誘導(dǎo)其他類型的細(xì)胞死亡。

綜上所述，在HN2 染毒BEAS-2B 細(xì)胞的體外模型中，100 μmol/L 的Mito-TEMPO 干預(yù)表現(xiàn)出明顯的促損傷效應(yīng)，在這一過(guò)程中，Mito-TEMPO 干預(yù)顯著抑制了HN2誘導(dǎo)的線粒體ROS的過(guò)量產(chǎn)生，卻進(jìn)一步提高了細(xì)胞內(nèi)H2O2及總ROS水平，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，進(jìn)而增加了細(xì)胞毒性。Mito-TEMPO 的促HN2損傷作用可能獨(dú)立于凋亡、線粒體功能障礙和炎癥效應(yīng)(圖9)。本研究提示在糜爛性毒劑中毒救治中，不恰當(dāng)?shù)氖褂肕ito-TEMPO 可能具有一定的風(fēng)險(xiǎn)和危害，也揭示了高劑量Mito-TEMPO 在臨床使用可能出現(xiàn)的副作用及相關(guān)機(jī)制。生物體作為一個(gè)由多細(xì)胞、多組織和多器官構(gòu)成的復(fù)雜功能體和生命體，毒物和藥物的生物學(xué)效應(yīng)和相互作用往往十分復(fù)雜，本研究目前僅在單一類型的細(xì)胞(BEAS-2B 細(xì)胞)上驗(yàn)證了單一濃度Mito-TEMPO(100 μmol/L)干預(yù)對(duì)單一濃度HN2(8 μmol/L)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響，還缺乏劑量-效應(yīng)關(guān)系的深入探討和多類型細(xì)胞的確切驗(yàn)證，需要進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)。為了深入闡明Mito-TEMPO對(duì)糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷中的藥理學(xué)作用，我們將在HN2和硫芥染毒的體內(nèi)模型中進(jìn)一步客觀評(píng)價(jià)其抗氧化功能和藥理學(xué)作用。

圖9 100 μmol/L的Mito-TEMPO干預(yù)對(duì)HN2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響