4種常用水產(chǎn)藥物對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性

菅玉霞 李莉 王曉龍 高鳳祥 王雪 郭文 胡發(fā)文

(1 山東省海洋科學(xué)研究院，山東青島 266104；2 青島市海洋生物種質(zhì)資源挖掘與利用工程實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266104)

黃姑魚(NibeaalbifloraRichardson)俗稱黃姑子，隸屬于石首魚科(Sciaenidae)、黃姑魚屬(Nibea)，是近海暖溫性中下層魚類[1]。黃姑魚廣泛分布于太平洋西北部沿海，在我國(guó)的渤海灣、黃海南部和日本南部沿海都有其產(chǎn)卵場(chǎng)。黃姑魚的性成熟年齡一般為2～3齡，適溫范圍在8～33 ℃，適鹽范圍為10～40[2]。該魚肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，苗種成活率高，生長(zhǎng)快，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。2018年山東省首次將黃姑魚作為增殖放流品種，這對(duì)于其種群恢復(fù)和生態(tài)環(huán)境改善都具有重大意義。常用藥物對(duì)水產(chǎn)生物的毒性試驗(yàn)已有不少報(bào)道[3-7]。目前對(duì)黃姑魚的研究主要集中在人工繁育、苗種培育及種質(zhì)資源等方面[8-11]，尚少見常用水產(chǎn)藥物對(duì)其毒性的研究報(bào)道。本試驗(yàn)通過研究甲醛、高錳酸鉀、氟苯尼考和聚維酮碘4種藥物對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性作用，了解這幾種藥物對(duì)黃姑魚的半致死濃度(semi-lethal concentration，LC50)和安全濃度(safe concentration，SC)，研究結(jié)果可為黃姑魚健康養(yǎng)殖中的藥物監(jiān)管提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用黃姑魚幼魚購(gòu)自威海市文登區(qū)海和水產(chǎn)育苗有限公司，平均全長(zhǎng)(5.61±0.07)cm，體質(zhì)量(1.65±0.06)g，為2020年6月人工繁育的同一批次魚苗。挑選身體無(wú)畸形、攝食正常、反應(yīng)敏捷的健康幼魚用于試驗(yàn)。試驗(yàn)開始前，將魚放在室內(nèi)玻璃鋼水槽中暫養(yǎng)7 d，試驗(yàn)前1 d停止投喂。

試驗(yàn)用水為經(jīng)充分沉淀和曝氣的地下水，鹽度24～26，pH 8.0～8.2，溶解氧在7.0 mg/L以上，水溫(17.0±1.0)℃。試驗(yàn)用塑料箱規(guī)格為70 cm×50 cm×45 cm(長(zhǎng)×寬×高)。試驗(yàn)過程中微充氧，不投飼。

試驗(yàn)用藥物情況詳見表1。

表1 各試驗(yàn)藥物的產(chǎn)品規(guī)格和生產(chǎn)廠家

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用靜態(tài)試驗(yàn)法[12]。先根據(jù)各種藥物的常用劑量[13]適當(dāng)擴(kuò)大或縮小質(zhì)量濃度范圍進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，持續(xù)觀察96 h，確定黃姑魚幼魚24 h全部致死和96 h全部存活的質(zhì)量濃度范圍。正式試驗(yàn)時(shí)，每種藥物按等對(duì)數(shù)間距法設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度組：甲醛質(zhì)量濃度分別為50.00、65.98、87.06、114.87、151.57、200.00 mg/L；高錳酸鉀質(zhì)量濃度分別為2.00、2.30、2.64、3.03、3.48、4.00 mg/L；氟苯尼考質(zhì)量濃度分別為3 000.00、3 322.00、3 679.59、4 075.68、4 514.40、5 000.00 mg/L；聚維酮碘質(zhì)量濃度分別為5.00、5.49、6.03、6.63、7.28、8.00 mg/L。每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放20尾幼魚，另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組。高錳酸鉀先用蒸餾水制成母液，再根據(jù)有效質(zhì)量濃度比例進(jìn)行添加；其余藥品則根據(jù)試驗(yàn)質(zhì)量濃度直接取適量加入試驗(yàn)水中溶解，每24 h更換1次藥液。試驗(yàn)開始后，連續(xù)觀察黃姑魚的游動(dòng)情況及中毒癥狀，分別記錄24、48、72、96 h幼魚的存活數(shù)量，及時(shí)清理死亡個(gè)體。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0軟件的Probit模塊，求出4種藥物的半致死濃度(LC50)、安全濃度(SC)和95%置信區(qū)間[14]。利用EXCEL 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立藥物質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)和死亡率的直線回歸方程。利用藥物毒性蓄積程度系數(shù)(MAC，%)來(lái)分析黃姑魚體內(nèi)藥物的蓄積、降減變化[15]。相關(guān)計(jì)算公式如下。

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC5048 h LC50)2

(1)

MAC=100×(LC50t2-LC50t1)/(LC50t0-LC50tm)

(2)

式(1)～(2)中，LC50t1和LC50t2分別為t1和t2時(shí)刻的半致死濃度(mg/L)，LC50t0和LC50tm分別為試驗(yàn)初始和結(jié)束時(shí)的半致死濃度(mg/L)。

2 結(jié)果

2.1 甲醛對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性

黃姑魚幼魚在不同質(zhì)量濃度甲醛溶液中的死亡情況見圖1。由圖1可見，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增大，甲醛對(duì)黃姑魚的毒性作用增強(qiáng)，黃姑魚死亡率增大。黃姑魚幼魚在高質(zhì)量濃度的甲醛溶液中急速游動(dòng)，中毒后開始側(cè)游并逐漸側(cè)臥不動(dòng)。魚體死亡后，其體色發(fā)白，身體表面有大量黏液。在質(zhì)量濃度為200.00 mg/L的甲醛溶液中，試驗(yàn)魚3.5 h即出現(xiàn)沉底死亡，24 h死亡率達(dá)100%。當(dāng)甲醛質(zhì)量濃度為151.57 mg/L時(shí)，72 h幼魚死亡率達(dá)100%。當(dāng)甲醛質(zhì)量濃度為65.98 mg/L時(shí)，幼魚48 h出現(xiàn)死亡，死亡率僅為3.33%。對(duì)照組試驗(yàn)魚在試驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡。

圖1 黃姑魚幼魚在不同質(zhì)量濃度甲醛溶液中的死亡率

2.2 高錳酸鉀對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性

黃姑魚幼魚在不同質(zhì)量濃度高錳酸鉀溶液中的死亡情況見圖2。由圖2可見，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增大，高錳酸鉀對(duì)黃姑魚的毒性作用逐漸增強(qiáng)，黃姑魚死亡率呈明顯升高的趨勢(shì)。當(dāng)高錳酸鉀 質(zhì)量濃度為4.00 mg/L時(shí)，黃姑魚幼魚反應(yīng)強(qiáng)烈，試驗(yàn)開始后2 h魚體就出現(xiàn)失衡、側(cè)翻現(xiàn)象，3.5 h幼魚出現(xiàn)死亡，24 h死亡率為66.67%，48 h死亡率達(dá)100%。死亡魚體表黏液增多，鰓組織損傷嚴(yán)重，口張開。當(dāng)高錳酸鉀質(zhì)量濃度為2.00 mg/L時(shí)，96 h試驗(yàn)魚的死亡率僅為5.00%。對(duì)照組在試驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡。

圖2 黃姑魚幼魚在不同質(zhì)量濃度高錳酸鉀溶液中的死亡率

2.3 氟苯尼考對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性

黃姑魚幼魚在不同質(zhì)量濃度氟苯尼考溶液中的死亡情況見圖3。由圖3可見，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增大，氟苯尼考對(duì)黃姑魚的毒性作用逐漸增強(qiáng)，黃姑魚死亡率升高。魚體中毒后側(cè)游，鰓蓋張合緩慢，死亡后魚的體表、鰭條等出現(xiàn)充血現(xiàn)象。當(dāng)氟苯尼考質(zhì)量濃度為5 000.00 mg/L時(shí)，4 h有幼魚沉底死亡，24 h試驗(yàn)魚死亡率高達(dá)86.67%；當(dāng)氟苯尼考質(zhì)量濃度為3 000.00 mg/L時(shí)，72 h幼魚的死亡率僅為10.00%。對(duì)照組在試驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡。

圖3 黃姑魚幼魚在不同質(zhì)量濃度氟苯尼考溶液中的死亡率

2.4 聚維酮碘對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性

黃姑魚幼魚在不同質(zhì)量濃度聚維酮碘溶液中的死亡情況見圖4。由圖4可見，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增大，聚維酮碘對(duì)黃姑魚的毒性作用逐漸增強(qiáng)，黃姑魚死亡率明顯升高。魚體中毒后表現(xiàn)為狂躁不安，在藥液中上下竄游，濃度較高的組甚至有試驗(yàn)魚躍出箱外。聚維酮碘質(zhì)量濃度為5.00 mg/L的組，24 h幼魚死亡率為1.67%；而聚維酮碘質(zhì)量濃度為8.00 mg/L的組，1 h魚體出現(xiàn)側(cè)翻，2 h即有幼魚沉底死亡，24 h死亡率達(dá)100%。對(duì)照組在試驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡。

圖4 黃姑魚幼魚在不同質(zhì)量濃度聚維酮碘溶液中的死亡率

2.5 4種藥物對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性特征

甲醛、高錳酸鉀、氟苯尼考和聚維酮碘對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性特征見表2。4種藥物對(duì)黃姑魚幼魚的毒性大小為：高錳酸鉀>聚維酮碘>甲醛>氟苯尼考。4種藥物對(duì)黃姑魚幼魚的藥物毒性蓄積程度系數(shù)(MAC)隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中高錳酸鉀和氟苯尼考下降較快，而甲醛和聚維酮碘下降較慢。

表2 4種藥物對(duì)黃姑魚幼魚的急性毒性特征分析

通過對(duì)4種水產(chǎn)藥物急性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在相同試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)條件下，不同試驗(yàn)藥物、藥物不同質(zhì)量濃度對(duì)黃姑魚的致死效果存在顯著差異(見表3)。

表3 4種藥物對(duì)黃姑魚幼魚急性毒性的回歸方程分析

3 討論

3.1 4種藥物對(duì)黃姑魚幼魚的毒性評(píng)價(jià)及用藥安全

半致死濃度是評(píng)價(jià)藥物對(duì)水生動(dòng)物毒性大小的重要指標(biāo)，半致死濃度值(LC50)與藥物的毒性呈負(fù)相關(guān)[16]。實(shí)際生產(chǎn)中常以96 h半致死濃度來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)水生動(dòng)物的毒性大小，根據(jù)有毒物質(zhì)對(duì)魚類毒性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[17]，急性毒性96 h半致死濃度低于0.1 mg/L為劇毒，0.1～1.0 mg/L為高毒，1.0～10.0 mg/L為中毒，高于10.0 mg/L為低毒。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高錳酸鉀和聚維酮碘對(duì)黃姑魚幼魚的96 h半致死濃度分別為3.09、6.37 mg/L，屬于中毒藥物；甲醛和氟苯尼考對(duì)黃姑魚幼魚的96 h半致死濃度分別為98.67 mg/L和3 261.90 mg/L，屬于低毒藥物。

甲醛具有廣譜、高效、低殘留等特點(diǎn)，以前常作為水產(chǎn)動(dòng)物及預(yù)防寄生蟲病等的殺菌劑[18]。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，甲醛對(duì)黃姑魚幼魚的安全質(zhì)量濃度(SC)為25.40 mg/L，與泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)(25.30 mg/L)[19]接近，高于藍(lán)點(diǎn)笛鯛(Lutjanusrivulatus)(19.88 mg/L)[20]，遠(yuǎn)低于雙棘黃姑魚(Nibeadiacanthus)(71.39 mg/L)[21]。田喆等[22]在研究體長(zhǎng)(1.48±0.35)cm、體質(zhì)量(0.43±0.09)g的黃姑魚幼魚對(duì)甲醛的耐受性時(shí)得出，其安全濃度為8.66 mg/L，與本試驗(yàn)結(jié)果有較大差異，究其原因，可能與試驗(yàn)條件，以及試驗(yàn)魚的規(guī)格大小、魚的體質(zhì)和免疫力等有關(guān)。

高錳酸鉀具有高氧化性，其通過氧化菌體的活性基團(tuán)而呈現(xiàn)殺菌作用，以前曾被用作有效防治魚、蝦等的細(xì)菌、真菌和寄生蟲類疾病的藥物[23]。然而，在中性或堿性環(huán)境下，高錳酸鉀被還原生成二氧化錳，二氧化錳與蛋白質(zhì)結(jié)合而生成的蛋白復(fù)合物沉淀易損傷魚類的鰓組織[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高錳酸鉀對(duì)黃姑魚幼魚的安全質(zhì)量濃度為0.74 mg/L，與泥鰍(0.75 mg/L)[19]接近，比梭魚(Lizahaematocheila)(0.24 mg/L)[25]高，而略低于菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)(0.95 mg/L)[26]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥應(yīng)當(dāng)符合國(guó)家和地方有關(guān)農(nóng)藥、漁藥安全使用的規(guī)定和標(biāo)準(zhǔn)。水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的生產(chǎn)資料，其質(zhì)量不僅關(guān)系到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，更關(guān)系到養(yǎng)殖水產(chǎn)品的質(zhì)量安全以及食品安全、生態(tài)安全。甲醛和高錳酸鉀雖未列入最新版2020年“水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙1號(hào)”禁用藥物名錄，但也未列入“水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2號(hào)”(已批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥)，因此建議在實(shí)際生產(chǎn)中要加強(qiáng)藥物監(jiān)管，規(guī)范用藥。

氟苯尼考抑菌譜廣，吸收好，無(wú)毒副作用，目前已替代氯霉素被用于防治多種由敏感細(xì)菌引起的動(dòng)物疾病[27]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，氟苯尼考對(duì)黃姑魚幼魚的安全質(zhì)量濃度為760.64 mg/L，遠(yuǎn)高于鯽(Carassiusauratus)(304.13 mg/L)[28]，鱘(Acipensersturio)(193.69 mg/kg)[29]。王瑞雪等[30]、徐力文等[31]的研究表明，氟苯尼考的代謝與轉(zhuǎn)化通常在動(dòng)物肝臟和腎臟中進(jìn)行，過量使用會(huì)造成動(dòng)物器官的不可逆性損傷，因此，在生產(chǎn)上使用時(shí)不可超過其常規(guī)劑量，同時(shí)須加長(zhǎng)休藥期。

聚維酮碘具有高效、低毒、無(wú)毒副作用的特點(diǎn)，可以廣泛用于各種養(yǎng)殖器具的消毒，也可殺滅大部分病毒、細(xì)菌及霉菌孢子等[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，聚維酮碘對(duì)黃姑魚幼魚的安全質(zhì)量濃度為1.77 mg/L，與丁魚歲(Tincatinca)(1.85 mg/L)相近[33]，高于細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)(0.71 mg/L)[34]，而低于漠斑牙鲆(Paralichthyslethostigma)(4.06 mg/L)[35]、西雜鱘幼魚(Acipenserschrenckii×A.baerii)(2.37 mg/L)[36]。龔珞軍等[37]的研究表明，生產(chǎn)中適合用于養(yǎng)殖水體消毒潑灑的聚維酮碘質(zhì)量濃度為4.5～7.5 mg/m3(以有效碘計(jì))，因此聚維酮碘可用于黃姑魚的疾病防治，但是也要考慮水溫、pH、碘易揮發(fā)、黃姑魚幼魚狀態(tài)等因素的影響。

3.2 4種藥物在黃姑魚幼魚體內(nèi)的蓄積與降減特征分析

毒物在生物體內(nèi)的蓄積與降減狀況是評(píng)價(jià)毒物毒效和分析生物耐毒能力的基礎(chǔ)。常用藥物毒性蓄積程度系數(shù)(MAC)作為生物對(duì)毒物敏感程度差異的指示參數(shù)，MAC值越大，說(shuō)明毒效蓄積程度越高，致死率就越高，MAC大于0，說(shuō)明蓄積作用強(qiáng)于降減作用，反之亦然[15，38]。

由表2可見，4種藥物的MAC均大于0，并在24～48 h出現(xiàn)最大值，說(shuō)明此階段毒性在黃姑魚體內(nèi)的蓄積作用較強(qiáng)。MAC的最小值出現(xiàn)在高錳酸鉀和氟苯尼考72～96 h試驗(yàn)中，說(shuō)明此階段藥物降減毒性的能力較強(qiáng)，高錳酸鉀72～96 h的MAC值是24～48 h的10.86%，氟苯尼考72～96 h的MAC值是24～48 h的13.05%。MAC的最大值和最小值均出現(xiàn)在高錳酸鉀試驗(yàn)中，說(shuō)明黃姑魚對(duì)高錳酸鉀反應(yīng)較為敏感。試驗(yàn)結(jié)果顯示，聚維酮碘和甲醛的MAC值在48～96 h變化不大，說(shuō)明此階段藥物的蓄積作用較強(qiáng)，降減能力較差。因此在探討藥物的毒性效應(yīng)時(shí)，應(yīng)當(dāng)分析藥物毒性蓄積變化、藥物自然降減和時(shí)效等的多重影響。