營養(yǎng)素干預(yù)對(duì)癲癇小鼠的發(fā)作及行為學(xué)影響

金伊楠 丁虹

關(guān)鍵詞：癲癇，營養(yǎng)素干預(yù)，白楊素，行為學(xué)

【中圖分類號(hào)】 ?R742.1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）16--03

癲癇?。‥P）是全世界最常見的慢性疾病之一，是一種發(fā)作性、致殘性的腦功能障礙性疾病，影響數(shù)千萬人[1]，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的慢性腦部疾病，患者的發(fā)作形式多樣，可能會(huì)突然間毫無緣由的發(fā)作，可表現(xiàn)為抽搐、痙攣、昏厥、兩眼發(fā)直等臨床癥狀，具有發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性和刻板性的特征?；颊叩恼Ｉ詈蜕硇慕】刀家虬d癇發(fā)作的不可控而受到極大的損害，其影響不僅停留在患者本人，更是波及其家庭，尤其對(duì)于目前很多嬰幼兒患者及其家屬而言，遭受著難以想象的壓力。EP的發(fā)病原因復(fù)雜多樣，往往是多種因素綜合造成的結(jié)果，包括基因、創(chuàng)傷性腦損傷、中樞系統(tǒng)感染、腦血管疾病以及與認(rèn)知功能損傷相關(guān)的退行性神經(jīng)疾病[1]。對(duì)于嬰幼兒患者而言，EP使得其神經(jīng)發(fā)育異常，認(rèn)知功能、運(yùn)動(dòng)能力均無法正常發(fā)育;對(duì)于成人患者，EP使得他們的生活質(zhì)量下降，同時(shí)在心理方面承受著來自社會(huì)、家庭等各方面的壓力，加之其可能誘發(fā)的焦慮或抑郁狀態(tài)，使患者的正常生活工作都收到極大影響。有研究表明，EP與精神疾病相關(guān)聯(lián)，可能增加患者患上精神疾病的可能，使患者壽命縮短[2]。目前常用的治療藥物包括苯妥英鈉、奧卡西平、托吡酯等，也可以通過手術(shù)治療進(jìn)行神經(jīng)刺激、切斷等方式，由于患者可能出現(xiàn)的精神問題，可以適當(dāng)輔以心理治療。然而，許多患者可能在疾病的發(fā)展過程中出現(xiàn)耐藥，而面臨治療瓶頸，仍需要不斷開發(fā)尋找安全有效的新藥。本研究通過營養(yǎng)素干預(yù)的方式來篩選研究幾種營養(yǎng)素對(duì)癲癇小鼠的疾病發(fā)展的控制作用，以及對(duì)小鼠精神狀態(tài)的影響。

材料

1.試劑和藥物

2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取8-12周清潔級(jí)健康成年雄性昆明小鼠共100只，體重18～22g，購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。喂養(yǎng)環(huán)境：飼養(yǎng)在12小時(shí)光亮/黑暗環(huán)境中，室內(nèi)恒溫22～25℃，分籠飼養(yǎng)，自由攝食及進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)前1周小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理均參照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例法（1988，No.134）執(zhí)行。

方法

1.造模

模型：癲癇模型

Day1-day11腹腔注射PTZ（37mg/kg）制備慢性癲癇模型，day12腹腔注射PTZ（45mg/kg），后連續(xù)1h觀察各組小鼠癲癇發(fā)作情況，并記錄發(fā)作的等級(jí)、持續(xù)時(shí)間、潛伏期及死亡情況。

2.動(dòng)物分組及藥物干預(yù)

將60只小鼠隨機(jī)分為正常組，PTZ組，PTZ+白楊素組，PTZ+蜂膠組，PTZ+梅芹茶組，PTZ+NMN組，PTZ+芹菜素組，PTZ+柚皮素組，PTZ+金合歡素組，PTZ+胞二磷膽堿片組。

（1）♂正常對(duì)照組：每日腹腔注射0.9%NaCl（0.1ml/10g），每日灌胃蒸餾水（0.1ml/10g），共計(jì)42天。（2）♂PTZ組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃蒸餾水（0.1ml/10g），共計(jì)42天。（3）♂PTZ+白楊素組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃白楊素50mg/kg（0.1ml/10g）。共計(jì)42天。（4）♂PTZ+梅芹茶組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃梅芹茶2.5g/kg（0.1ml/10g）。共計(jì)42天。（5）♂PTZ+蜂膠組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃蜂膠100mg/kg（0.1ml/10g）。共計(jì)42天。（6）♂PTZ+NMN組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃NMN 90mg/kg（0.1ml/10g）。共計(jì)42天。（7）♂PTZ+芹菜素組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃芹菜素20mg/kg（0.1ml/10g）。共計(jì)42天。（8）♂PTZ+柚皮素組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃柚皮素20mg/kg（0.1ml/10g）。共計(jì)42天。（9）♂PTZ+金合歡素組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃金合歡素20mg/kg（0.1ml/10g）。共計(jì)42天。（10）♂PTZ+胞二磷膽堿組：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃胞二磷膽堿30mg/kg（0.1ml/10g）。共計(jì)42天。

3.觀察指標(biāo)

營養(yǎng)素干預(yù)對(duì)小鼠行為學(xué)功能的影響

以往研究結(jié)果表明，PTZ誘導(dǎo)癲癇小鼠表現(xiàn)出一系列行為障礙，包括運(yùn)動(dòng)功能障礙和抑郁樣行為。本研究通過各種行為學(xué)測(cè)試，包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，對(duì)動(dòng)物行為進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析。為保證每只小鼠在同一條件下進(jìn)行測(cè)試，每只小鼠參與各個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的順序保持不變。行為學(xué)測(cè)試的實(shí)施遵循雙盲的原則，由不清楚各組小鼠分組及藥物干預(yù)情況的測(cè)試者進(jìn)行試驗(yàn)。

（1）小鼠癇性發(fā)作行為學(xué)評(píng)定

小鼠癇性發(fā)作等級(jí)評(píng)分

每次PTZ腹腔注射后，觀察60min小鼠的行為學(xué)變化，參照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，記錄癇性發(fā)作等級(jí)。本實(shí)驗(yàn)采取Racine（1972）行為學(xué)分級(jí)法對(duì)小鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)。（見表1）

全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作和極小陣攣性發(fā)作的潛伏期

每次PTZ腹腔注射后，參照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，觀察大鼠出現(xiàn)的從輕度肌陣攣性抽搐發(fā)作到面部和前肢陣攣，沒有失去扶正反射的連續(xù)癇性發(fā)作的間歇期為極小陣攣發(fā)作潛伏期。而出現(xiàn)平衡跌倒，全身強(qiáng)直-陣攣大發(fā)作的間歇期為全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作潛伏期。

（2）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

將待觀察小鼠置于內(nèi)壁黑色的無頂盒子中，其規(guī)格為50cm×50cm×30cm，盒子底部被圖像采集系統(tǒng)劃分為25個(gè)正方形小格，小鼠應(yīng)從正中央的小格放入，開始實(shí)驗(yàn)，記錄5min內(nèi)活動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)（四周無墻壁的小格）滯留時(shí)間、靜止不動(dòng)時(shí)間、直立次數(shù)、大小便次數(shù)。

（3）懸尾實(shí)驗(yàn)

懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）是通過無法克服不正常體位而誘導(dǎo)產(chǎn)生抑郁絕望行為，屬于“干型”行為絕望模型。其原理是小鼠被懸尾后，會(huì)在本能的驅(qū)使下嘗試逃脫，但由于外力無法逃脫，進(jìn)而會(huì)放棄掙扎進(jìn)入特有的抑郁不動(dòng)狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)過程中記錄動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間來反映抑郁狀態(tài)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尾部進(jìn)行固定，使其頭部懸掛朝下，動(dòng)物在該環(huán)境中掙扎，企圖擺脫該困境，在經(jīng)過努力仍無法擺脫后，出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，顯示“行為絕望”狀態(tài)。動(dòng)物在該環(huán)境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫，從而提供了一個(gè)無可回避的壓迫環(huán)境，一段時(shí)間的實(shí)驗(yàn)后，記錄處于該環(huán)境的動(dòng)物產(chǎn)生絕望的不動(dòng)狀態(tài)過程中的一系列參數(shù)，動(dòng)物的表現(xiàn)出的這種典型的“不動(dòng)狀態(tài)”，反映了一種被稱之為“行為絕望狀態(tài)”，記錄處于該環(huán)境的動(dòng)物產(chǎn)生絕望的不動(dòng)狀態(tài)過程中的一系列參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中，我們將小鼠的尾部固定懸掛開始計(jì)時(shí)6min，記錄6min內(nèi)其懸尾不動(dòng)的時(shí)間與掙扎攀爬的次數(shù)來反應(yīng)其精神狀態(tài)。

（4）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（FST）系統(tǒng)適用于大鼠、小鼠或其他實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，通過將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于一個(gè)局限的環(huán)境中（如水中），與TST相似，一段時(shí)間的實(shí)驗(yàn)后，動(dòng)物即表現(xiàn)出“不動(dòng)狀態(tài)”，反映出“行為絕望狀態(tài)”，記錄處于該環(huán)境的動(dòng)物產(chǎn)生絕望的不動(dòng)狀態(tài)過程中的一系列參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中我們將小鼠放入水中后立刻開始計(jì)時(shí)8min，通過記錄后6min內(nèi)小鼠漂浮不動(dòng)的時(shí)間來反應(yīng)小鼠的精神狀態(tài)。

結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行11周的培養(yǎng)，并定期記錄每只小鼠的癲癇發(fā)作情況，最后計(jì)算平均得到每組小鼠的發(fā)作情況。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了白楊素、蜂膠、梅芹茶、中濃度NMN、芹菜素、柚皮素、金合歡素和胞二磷膽堿進(jìn)行干預(yù)。

1.癲癇發(fā)作情況變化

通過統(tǒng)計(jì)結(jié)果（見圖1.2）比較可以發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，不同營養(yǎng)素中部分對(duì)癲癇的控制有一定的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白楊素、中濃度NMN、柚皮素、金合歡素和胞二磷膽堿都有一定的效果。而其余營養(yǎng)素的干預(yù)效果較差。白楊素整體效果較好，在前期逐漸顯現(xiàn)出對(duì)癲癇發(fā)作的控制，隨著時(shí)間的推移，與模型組相比也有效抑制了癲癇的進(jìn)程;蜂膠在前四周表現(xiàn)較好，然而之后癲癇發(fā)作的進(jìn)展并未得到控制，甚至高于正常組的發(fā)作等級(jí);梅芹茶在前期有一定的控制效果，但最終與模型組相差無異，認(rèn)為無效;中濃度的NMN始終表現(xiàn)出良好的抑制作用，有效控制了癲癇的發(fā)作等級(jí)在1級(jí)到2級(jí)之間;芹菜素比蜂膠效果稍好，其控制效果在前六周表現(xiàn)良好，然而在之后并不能維持其干預(yù)作用;柚皮素在第11周將癲癇控制在1級(jí)左右，最終效果最優(yōu)，實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)過程中存在時(shí)有控制效果下降的問題，但整體干預(yù)作用較好;金合歡素在后期表現(xiàn)較好，有效控制并維持其干預(yù)效果;使用胞二磷膽堿與模型組相比，始終維持了較好的控制干預(yù)效果，期間也并沒有太大的波動(dòng)。

2.小鼠行為學(xué)變化

（1）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)小鼠的抑郁情況進(jìn)行評(píng)估，所得結(jié)果與癲癇發(fā)作的干預(yù)結(jié)果略有出入。（見圖3）從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，模型組的水平得分與總得分均高于正常組，說明癲癇小鼠較正常小鼠更為焦慮。白楊素、蜂膠、柚皮素和金合歡素干預(yù)的小組其水平得分與總得分均比模型組低，更接近正常組，說明這幾種營養(yǎng)素的干預(yù)對(duì)癲癇小鼠的精神狀態(tài)有較好的干預(yù)效果。梅芹茶、中濃度NMN和芹菜素干預(yù)組的小鼠與模型組相比水平得分與總得分有所下降，但高于正常組，表明其對(duì)癲癇小鼠的焦慮狀態(tài)有所改善，但最終效果并不及上述的其他幾種干預(yù)。胞二磷膽堿的干預(yù)對(duì)癲癇小鼠的焦慮狀態(tài)并沒有明顯的改善。各組小鼠的糞便粒數(shù)與正常組相差無幾，對(duì)焦慮狀態(tài)的反映不夠直觀明顯。就直立次數(shù)而言，正常組與模型組在均值上差異不顯著，但誤差范圍內(nèi)正常組的直立次數(shù)更多，表明癲癇小鼠對(duì)外界的求知欲下降，有一定的抑郁傾向。白楊素、梅芹茶和中濃度NMN的干預(yù)組小鼠直立次數(shù)較模型組更高，說明三者能幫助小鼠減輕抑郁。其余營養(yǎng)素干預(yù)組的小鼠直立次數(shù)并沒有顯著提高，對(duì)小鼠抑郁傾向并沒有明顯改善。正常組的中央?yún)^(qū)停留時(shí)間叫模型組更長，表明癲癇小鼠可能有焦慮傾向。白楊素與金合歡素干擾組的中央滯留時(shí)間顯著下降，表明這兩種營養(yǎng)素對(duì)小鼠的焦慮狀態(tài)可能有較好的緩解作用，其他營養(yǎng)素的干預(yù)作用并不明顯。

（2）懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看（見圖4），正常組的懸尾不動(dòng)時(shí)間與攀爬次數(shù)都高于模型組，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，所有的營養(yǎng)素干預(yù)對(duì)癲癇小鼠的求生欲并無提高，對(duì)抑郁狀態(tài)也沒有明顯改善，各組的懸尾不動(dòng)時(shí)間與攀爬次數(shù)與模型組相比無改善。

（3）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，正常組的不動(dòng)時(shí)間高于模型組，有待進(jìn)一步重復(fù)驗(yàn)證。根據(jù)結(jié)果分析（見圖4），白楊素干預(yù)組和梅芹茶干預(yù)組均表現(xiàn)出較強(qiáng)的求生欲，表明其精神狀態(tài)較好;中濃度NMN干預(yù)組和胞二磷膽堿干預(yù)組的時(shí)間與模型組相差不大，說明其對(duì)癲癇小鼠的抑郁狀態(tài)改善不大。其余組別與正常組相比沒有太大差異，與模型組相比也沒有更多的改善。

3.討論

實(shí)驗(yàn)通過PTZ致毒性進(jìn)行癲癇小鼠的造模，利用黃酮類營養(yǎng)素干預(yù)來比較其有效性，進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。通過對(duì)小鼠11周的培養(yǎng)記錄，可以發(fā)現(xiàn)白楊素、中濃度NMN、柚皮素、金合歡素和胞二磷膽堿能夠改善癲癇的發(fā)作，相較于其他營養(yǎng)素，它們的有效性更持久;通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可以得知，使用白楊素、蜂膠、柚皮素和金合歡素干預(yù)的癲癇小鼠在抗焦慮方面具有較好的表現(xiàn)，而白楊素、梅芹茶和中濃度NMN的干預(yù)組的癲癇小鼠在求知欲方面表現(xiàn)優(yōu)于模型組，表明其抑郁傾向得到緩解;在懸尾實(shí)驗(yàn)中，各營養(yǎng)素的表現(xiàn)相差無幾;在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，白楊素干預(yù)組和梅芹茶干預(yù)組的小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的求生欲。因此，結(jié)合所有實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，在所有營養(yǎng)素中，白楊素在各方面的表現(xiàn)最佳，它能有效改善癲癇的發(fā)作，同時(shí)對(duì)癲癇小鼠的精神狀態(tài)也起到了很大的幫助作用。白楊素為5，7-二羥基黃酮，具有抗腫瘤、抗焦慮、抗炎、抗氧化等藥理活性，它能夠通過上調(diào)Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白進(jìn)而激活大鼠體內(nèi)抗氧化酶系和自由基清除系來減輕這些物質(zhì)對(duì)大鼠腦組織造成的損傷，另外，白楊素也可能通過上調(diào)p-ERK、同時(shí)下調(diào)NF-κB和p-P38的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用[3]。除此之外，有關(guān)于腦缺血-再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)表明，白楊素可通過上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF表達(dá)量而對(duì)腦缺血-再灌注損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。有研究[4]證明，白楊素可改善創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠前庭運(yùn)動(dòng)功能障礙，改善認(rèn)知記憶障礙，減輕焦慮/抑郁樣行為，其可能的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)和海馬DG區(qū)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來減輕神經(jīng)炎癥和預(yù)防神經(jīng)元凋亡。對(duì)于PTZ致毒性的癲癇小鼠而言，白楊素可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)減輕PTZ引發(fā)的腦內(nèi)炎癥，進(jìn)而對(duì)抗PTZ誘發(fā)的癲癇的發(fā)展。另一方面，白楊素具有抗抑郁/減輕焦慮的作用，對(duì)于癲癇誘發(fā)的焦慮和抑郁有一定的緩解作用。通過研究實(shí)驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)，部分營養(yǎng)素對(duì)癲癇的進(jìn)展具有一定的控制作用，同時(shí)也能緩解其帶來的精神方面的不良影響。通過營養(yǎng)素進(jìn)行干預(yù)是極具潛力的方向，藥物治療可能會(huì)帶來許多不良反應(yīng)，而營養(yǎng)素能夠避免對(duì)人體造成傷害，同時(shí)與藥物配合治療可能會(huì)達(dá)到更好的治療效果，或許營養(yǎng)素干預(yù)的方案能夠阻止一些患者病程發(fā)展為難治性癲癇，對(duì)于患者及其家庭而言都具有重大意義。對(duì)于無論是白楊素，還是實(shí)驗(yàn)涉及到的其他營養(yǎng)素，需要進(jìn)一步重復(fù)實(shí)驗(yàn)以及其他實(shí)驗(yàn)輔以驗(yàn)證來確定它們的干預(yù)效果。

事實(shí)上，目前癲癇普遍存在于我們的生活中，在嬰幼兒中的發(fā)病率也極高，對(duì)于許多家庭而言，面對(duì)新生命誕生的愉悅被疾病打破，家人承受著巨大的經(jīng)濟(jì)與心理負(fù)擔(dān)。而對(duì)營養(yǎng)素干預(yù)作用的研究或許將給這些家人帶來希望，通過營養(yǎng)素干預(yù)使得患者有機(jī)會(huì)擺脫鎮(zhèn)靜劑，走向新生活。因此對(duì)于營養(yǎng)素干預(yù)控制癲癇病程發(fā)展的深入研究與篩選具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]張萌，王蘭桂.癲癇發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志，2020，8（35）：31-32.

[2]馬慧萍，吳金華，蒙萍，等.白楊素對(duì)大鼠急慢性腦缺血損傷后氧化應(yīng)激和Nrf2/HO-1途徑的影響[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2015，27（12）：15-20..

[3]趙煦萌.白楊素對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠腦保護(hù)作用及其機(jī)制的研究[D].河北：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.DOI：10.7666/d.Y2337622.

[4]王葉葉，江羽，梁晨，等.白楊素對(duì)腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2019，21（4）：580-586.