楊樹(shù)MADS轉(zhuǎn)錄因子SVL基因克隆、原核表達(dá)與多克隆抗體制備

王冬莉，劉蕓杉,2，孟 森，卞 展*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520；2.重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100)

生長(zhǎng)在北半球的楊樹(shù)屬(Populus)含有約30種植株，在溫帶樹(shù)木中生長(zhǎng)速度最快。相對(duì)較小的基因組、大量的分子遺傳圖譜和成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系使得楊樹(shù)成為重要的林木模式植物。同時(shí)，楊樹(shù)還可以生產(chǎn)各種木材產(chǎn)品(木材、紙漿和紙張)，具有保持水土、涵養(yǎng)水源等功能[1]。然而，在楊樹(shù)整個(gè)生命過(guò)程中，非生物脅迫嚴(yán)重影響著楊樹(shù)生長(zhǎng)[2]。探究楊樹(shù)抵御非生物脅迫的分子及生理機(jī)制具有重要的意義。

轉(zhuǎn)錄因子常在生物的發(fā)育或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，MADS-box家族基因是其重要的組成部分[3]。MADS-box基因家族成員擁有保守的N端結(jié)構(gòu)，由大約60個(gè)氨基酸組成，與CArG位點(diǎn)結(jié)合后參與下游信號(hào)途徑[4]。目前，已有許多研究解析了不同物種的MADS基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、定位、蛋白基序組織及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，比如西瓜(Citrulluslanatus)、苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)、楊樹(shù)(Populustrichocarpa)、菊花(Chrysanthemumnankingense)、番茄(Solanumlycopersicum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)[5-10]。許多重要的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子決定花器官的形成、調(diào)節(jié)果實(shí)發(fā)育和胚胎發(fā)生。1990年，金魚(yú)草的基因defA-1突變后，花瓣轉(zhuǎn)化為萼片，雄蕊轉(zhuǎn)化為心皮，植株表現(xiàn)出“球藻”的形態(tài)[11]。SOC1(Suppressor of Overexpression of Constants1)基因整合光周期、溫度、激素和年齡等參與開(kāi)花途徑，同時(shí)受到2種拮抗開(kāi)花調(diào)節(jié)劑CO(CONSTANS)和FLC1(Flowering Locus C1)的調(diào)控，它們分別作為花的激活因子和抑制因子[12]。擬南芥fruitfull基因突變后消除了受精后長(zhǎng)角果伸長(zhǎng)的表型[13]。AGL15可能是調(diào)控種子發(fā)育的重要組成部分[14]。植物MADS基因在應(yīng)對(duì)非生物脅迫方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用。比如，過(guò)表達(dá)SlMBP22后的番茄通過(guò)影響生長(zhǎng)素、赤霉素信號(hào)影響植株的高度和葉片大小，且比野生型的番茄更耐干旱；脫水處理可以誘導(dǎo)SlMBP22基因表達(dá)[15]。SVP(Short Vegetative Pahse)在擬南芥中直接靶向細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP707A1/CYP707A3和葡萄糖苷酶AtBG1控制脫落酸含量，進(jìn)而抵御干旱脅迫[16]。目前，在楊樹(shù)中已經(jīng)克隆了有關(guān)MADS基因，但是多數(shù)集中在與花相關(guān)或營(yíng)養(yǎng)器官相關(guān)的研究中，有關(guān)其應(yīng)對(duì)非生物脅迫的研究欠缺[17-20]。

本研究以84K(Populusalba×Populusglandulosa'84K')楊樹(shù)為試驗(yàn)材料，對(duì)楊樹(shù)PtSVL(Short Vegetative Pahse-Like)進(jìn)行了克隆，并純化出融合蛋白，將融合蛋白作為抗原免疫新西蘭公兔以獲得多克隆抗體。使用抗體以期篩選出PtSVL潛在的互作蛋白，從而為探究PtSVL蛋白功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將84K楊樹(shù)培育在MS培養(yǎng)基中，幼苗高度達(dá)到8.5 cm左右時(shí)移植到土壤中(草炭土∶蛭石=3∶1)。在培養(yǎng)箱中(溫度25 ℃；相對(duì)濕度75%；16/8 h光照/黑暗)生長(zhǎng)2個(gè)月后，取葉片樣品，液氮速凍后立即保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 PtSVL蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及抗原性預(yù)測(cè) PtSVL蛋白的親/疏水性被ExPASy軟件中的ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線預(yù)測(cè)。Protean中的Jameson-Wolf方法被用來(lái)分析PtSVL蛋白的抗原指數(shù)等。

1.2.2PtSVL基因的克隆 依據(jù)楊樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)PopGenIE (https://popgenie.org/)中Potri.007G010800序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增PtSVL基因的上游和下游引物。上游引物序列為PtSVL-F(ATGGCAAGAGAGAGGATTCAGA)，下游引物序列為PtSVL-R(TCAGTTTGAAAATGGCAACCCCA)，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。以84K楊樹(shù)葉片cDNA為PCR模板，50 μL的PCR體系中含有2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix (10mM) 1 μL，cDNA 2 μL，SVL-F 2 μL，SVL-R 2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL和ddH2O 17 μL。PCR程序設(shè)置為：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；53 ℃，15 s；72 ℃，15 s；運(yùn)行35個(gè)循環(huán)后再經(jīng)72 ℃、5 min；結(jié)束程序。

1.2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段大小處的條帶。采用無(wú)縫克隆技術(shù)將基因鏈3×FLAG標(biāo)簽后連接到實(shí)驗(yàn)室保存的原核表達(dá)載體pET-B2M中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌B21(DH3)。挑取陽(yáng)性克隆在至LB培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后利用PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送至睿博興科測(cè)序。

1.2.4 目的蛋白小量表達(dá)與鑒定 在3 mL液體LB中加入pET-B2M-SVL-3×FLAG重組質(zhì)粒的單菌落，在37 ℃搖床中培養(yǎng)至濃度(OD600)約為0.6。取適量菌液作為對(duì)照，余下菌液加入IPTG誘導(dǎo)劑(終濃度0.5 mmol·L-1)作試驗(yàn)組，37 ℃搖床培養(yǎng)4 h。取對(duì)照組和試驗(yàn)組各0.15 mL，12 000 r·min-1離心2 min。取40 μL 1×loading buffer重懸裂解菌體沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)上清液。

1.2.5 蛋白大量表達(dá)、破菌檢測(cè) 在100 mL液體LB中加入100 μL原保存于-20 ℃的菌種，過(guò)夜培養(yǎng)。隨后將菌液接種于2 L LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至濃度(OD600)約0.6。加入誘導(dǎo)劑IPTG至其終濃度為0.5 mmol·L-1，30 ℃震蕩培養(yǎng)4 h。8 000 r·min-1離心3 min收集菌體后用50 mL預(yù)冷N(xiāo)TA-0緩沖液重懸菌體，冰浴30 min。使用功率200 W、工作3 s、暫停4 s的超聲破碎菌體25～30 min。16 000 r·min-14 ℃離心50 min，收集上清以及沉淀。SDS-PAGE檢測(cè)上清和沉淀，剩余部分置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 包涵體蛋白純化 使用50 mL STET緩沖液重懸沉淀，加入DTT至其終濃度1 mmol·L-1。功率200 W、工作3 s、暫停3 s的超聲促進(jìn)雜蛋白溶解，時(shí)間10 min。10 000 r·min-14 ℃離心10 min，去上清。重復(fù)以上步驟至上清透明。沉淀以1×PBS重懸后經(jīng)200 W、工作3 s、暫停3 s、時(shí)間5 min的超聲處理。16 000 r·min-14 ℃離心10 min，去上清。用4 mL 6 mol·L-1鹽酸胍重懸包涵體后加DTT至其終濃度5 mmol·L-1。轉(zhuǎn)速220 r·min-1，溫度37 ℃的搖床中培養(yǎng)3 h至包涵體全部溶解。10 000 r·min-14 ℃離心10 min，取10 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.7 蛋白親和純化 0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾蛋白溶液后。準(zhǔn)備N(xiāo)i-NTA柱，以1 mL·min-1的流速上樣蛋白溶液，以6 mol·L-1、pH為8.0鹽酸胍緩沖液洗Ni-NTA柱至流出液不含蛋白，即經(jīng)G250檢測(cè)后流出液不變色可視為不含蛋白。以含20、60、200 mmol·L-1和500 mmol·L-1咪唑的洗脫液分別進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液至G250檢測(cè)液不變色。以3倍柱體積去離子水洗滌柱料，并以20%乙醇封柱。在4 ℃下SDS-PAGE電泳檢測(cè)收集的洗脫液。4 ℃下超濾濃縮產(chǎn)物，SDS-PAGE電泳檢測(cè)10 μL的濃縮產(chǎn)物。

1.2.8 多克隆抗體制備和鑒定 將純化的融合蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1體積混合后進(jìn)行乳化。按500 μg·只-1劑量在2只白兔的皮下多點(diǎn)注射乳化后的融合蛋白。每只兔子免疫3～4次，免疫間隔時(shí)間為14 d。檢測(cè)免疫效價(jià)，待抗體表達(dá)恒定后采血分離血清，-20 ℃儲(chǔ)存。

1.2.9 抗體純化 以10倍柱床體積、流速為1 mL·min-1的去離子水將ProteinG柱沖洗3～5遍。再以10倍柱體積、流速1 mL·min-1的0.02 mol·L-1PB+0.3 mol·L-1NaCl沖洗3～5遍。取經(jīng)0.02 mol·L-1PB稀釋后的抗血清8 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上柱，流速為5～7 s·滴-1。用0.02 mol·L-1PB以2 s·滴-1的流速?zèng)_洗至無(wú)蛋白流出，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為G250不變藍(lán)。0.1 mol·L-1、pH為3.0的甘氨酸洗脫，并收集洗脫物，經(jīng)G250檢測(cè)洗脫產(chǎn)物至不變藍(lán)。飽和碳酸鈉調(diào)節(jié)洗脫產(chǎn)物的pH為中性。使用10 ku超濾管超濾濃縮至1～3 mL。用0.01 mol·L-1和pH為7.4的5 L PBS透析過(guò)夜，第2天更換PBS 1次。然后再使用去離子水沖洗層析柱至其為中性，最后使用5倍柱床體積的20%乙醇沖洗層析柱，4 ℃封存。

1.2.10 免疫效價(jià)ELISA檢測(cè) 將2 μg·mL-1的抗原放置在4 ℃中過(guò)夜包被。按1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000等進(jìn)行梯度稀釋待檢血清，各取100 μL加入96孔板作為試驗(yàn)組，空白血清為陰性對(duì)照。放置在37 ℃條件下溫育1 h后，用200 μL·孔-1的TBST洗滌3遍。10 000倍稀釋后羊抗兔-HRP作為二抗，37 ℃溫育45 min，用200 μL·孔-1的TBST洗滌3遍，用100 μL·孔-1TMB顯色液顯色20 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。

1.2.11 Western blotting檢測(cè) SDS-PAGE檢測(cè)分析純化的融合蛋白、楊樹(shù)葉片總蛋白、楊樹(shù)葉片蛋白上清液或沉淀，200 mA濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，37 ℃封閉液封閉2 h。加入免疫前兔血清或兔抗血清，37 ℃下?lián)u床孵育1 h。洗滌后，10 000倍稀釋后羊抗兔-HRP作為二抗，37 ℃孵育1 h。ECL試劑的A液、B液1∶1混合后滴于PVDF膜正面，暗室反應(yīng)2 min，顯影液反應(yīng)1 min，定影液定影1 min，晾干，標(biāo)定Marker后分析PtSVL抗血清的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtSVL蛋白的抗原性、親/疏水性和表面可及性的分析

SVL基因編碼蛋白由227個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)蛋白分子量為25.6 ku，3×FLAG標(biāo)簽蛋白的分子量為17.0 ku。由圖1可看出，豐富且均勻的潛在抗原表位位點(diǎn)分布在SVL蛋白上，抗原指數(shù)較高的區(qū)段為第1～16、20～37、41～43、50～53、9、88～121、125～132、138～220位和223～227位氨基酸。親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示PtSVL蛋白平均親水性為-0.654。親水性區(qū)段主要為第1～17、19～34、52～57、59～84、92～119、124～126、129～130、140～148、150～170位和172～218位氨基酸(圖1B)，序列親水性較強(qiáng)。丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和纈氨酸(Val)疏水性氨基酸分別占編碼氨基酸的4.0%、1.3%、4.8%、11.9%、2.6%、2.6%和5.7%。1～16、20～34和59～84等位點(diǎn)具有抗原指數(shù)較高、親水性較強(qiáng)等特征，說(shuō)明利用SVL蛋白制備抗體的可行性較強(qiáng)。采用Emini方法分析SVL蛋白表面可及性結(jié)果如圖1C所示，其表面可及性較高的區(qū)段為：1～7、9～12、21～28、30～33、68～72、74～80、100～115、127～ 130、141～144、152～157、161～168、175～181、184～198、202～206位和208～218位氨基酸。

綜合SVL蛋白親水性、表面可及性和抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果可知，許多區(qū)段在親水性、表面可及性、抗原表位可能性均較高，比如1～12、21～28、30～33、68～80、100～115 和175～198，使得這些預(yù)測(cè)區(qū)段有更大幾率成為抗原表位。

2.2 PtSVL基因的克隆和蛋白結(jié)構(gòu)分析

由圖2可見(jiàn)，PCR擴(kuò)增得到的PtSVL基因大小為684 bp，編碼227個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，PtSVL蛋白具有MIKC結(jié)構(gòu)，氨基端擁有高度保守的DNA結(jié)合MADS結(jié)構(gòu)域，中部有K結(jié)構(gòu)域。MADS和K結(jié)構(gòu)域由一個(gè)保守的I結(jié)構(gòu)域連接，而羧基末端C區(qū)域可能作為反式活化結(jié)構(gòu)域。

2.3 融合蛋白的表達(dá)與純化

SVL-3×FLAG融合蛋白主要以包涵體形式存在(圖3)。重組表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后小量表達(dá)、超聲波裂解后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)、大量表達(dá)及破菌檢測(cè)。在Ni-NTA樹(shù)脂層析柱中進(jìn)行純化。SDS-PAGE檢測(cè)分析經(jīng)10倍稀釋的純化融合蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖3，一條清晰的條帶顯示在42.0 ku處，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.4 抗體的純化結(jié)果

取純化后的PtSVL蛋白分4次免疫2只白兔，進(jìn)行兔抗楊樹(shù)PtSVL的多克隆抗體的制備。取免疫后的兔血清，利用Protein G Agarose進(jìn)行抗體純化。經(jīng)4倍稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析。結(jié)果見(jiàn)圖4，在45.0 ku附近有1條清晰條帶，與純化后的PtSVL融合蛋白顯示的大小基本吻合。經(jīng)Protein G親和層析柱純化后的抗體濃度超過(guò)10 mg·mL-1，純度約90%，抗體純化效果良好。

2.5 SVL融合蛋白血清抗體的免疫效價(jià)檢測(cè)和Western blotting檢測(cè)

利用間接ELISA法測(cè)定PtSVL多克隆抗體效價(jià)。將多克隆抗體從1∶2 000開(kāi)始依次稀釋至1∶32 768 000，羊抗兔-HRP稀釋10 000倍后作為二抗，加入底物顯色終止反應(yīng)，測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。圖5結(jié)果顯示多克隆抗體的效價(jià)超過(guò)1∶32 000，表明PtSVL融合蛋白可誘導(dǎo)兔產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，且抗體效價(jià)較高。為了檢測(cè)PtSVL多克隆抗體的特異性，2只不同兔子純化的抗體(G1397和G1398)作為一抗，10 000倍稀釋后羊抗兔-HRP作為二抗，對(duì)融合蛋白進(jìn)行Western blotting分析。結(jié)果顯示2 μg·mL-1免疫前兔血清與PtSVL蛋白之間未發(fā)生特異性反應(yīng)，免疫后兔血清純化的抗體與PtSVL蛋白在42.0 ku處雜交出明顯條帶(圖6A)。提取楊樹(shù)葉片的總蛋白，免疫前兔血清孵育時(shí)未在42.0 ku雜交出明顯條帶。圖6B紅框標(biāo)識(shí)顯示用純化的抗體孵育楊樹(shù)葉片蛋白上清液或者沉淀時(shí)，在42.0 ku處雜交出了明顯條帶。

3 結(jié)論與討論

楊樹(shù)具有獨(dú)特的木本結(jié)構(gòu)、多年生、雌雄異株等特性，與擬南芥、水稻等草本植物之間存在巨大的差異[1,7,21]。楊樹(shù)的維管形成層形成的次生木質(zhì)部組織產(chǎn)生木質(zhì)生物量的能力滿足社會(huì)對(duì)木材、紙漿和紙張的需求，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。在非生物脅迫中，干旱影響了根系對(duì)水分的吸收，導(dǎo)致蒸騰和光合作用減少，嚴(yán)重影響了楊樹(shù)的生長(zhǎng)和發(fā)育[22]。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的功能分析揭示了它們?cè)谥参镏饕l(fā)育過(guò)程(如開(kāi)花、花器官特征)以及與脅迫相關(guān)的發(fā)育過(guò)程(如脫落、果實(shí)成熟、衰老)中的作用。OSMADS26基因下調(diào)表達(dá)的水稻植株對(duì)稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)和水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性，對(duì)干旱也表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性[23]。

盡管目前已經(jīng)從各種模式植物中克隆獲得了一些MADS基因，并對(duì)部分基因的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了探究，比如轉(zhuǎn)錄因子SVP通過(guò)結(jié)合CYP707A1/CYP707A3和AtBG1啟動(dòng)子區(qū)的CArG位點(diǎn)進(jìn)而調(diào)控這些基因的表達(dá)[16]。AGL16能夠結(jié)合CYP707A3、AAO3和SDD1啟動(dòng)子的CArG并位點(diǎn)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致葉片氣孔密度和ABA水平的改變[24]。轉(zhuǎn)錄因子除了靶向下游基因的啟動(dòng)子中的特定位點(diǎn)，還可以通過(guò)蛋白互作激活或者抑制其他基因。比如，AtMYBL2直接與TT8蛋白結(jié)合，抑制DFR和TT8蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控花青素的合成[25]。FD和FT蛋白相互作用在莖尖起作用促進(jìn)花的轉(zhuǎn)變，并通過(guò)花分生組織特征基因AP1(APETALA1)的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)啟動(dòng)花的發(fā)育[26]。

為深入揭示楊樹(shù)MADS轉(zhuǎn)錄因子PtSVL在楊樹(shù)中的生物學(xué)功能和其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-B2M-PtSVL-3×FLAG，并成功在大腸桿菌表達(dá)菌株大量表達(dá)。純化后免疫新西蘭公兔，獲得了PtSVL多克隆抗體。經(jīng)間接ELISA法和Western blot 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)抗體的效價(jià)高，特異性好。本研究成功制備了PtSVL多克隆抗體，將為解析PtSVL基因功能和探究其上下游通路提供重要基礎(chǔ)。