細葉云南松混交林土壤微生物群落功能特性及與林分結構關系的研究

胡靚達，李遠發(fā)，周海菊，葉紹明，喻素芳

(廣西大學 林學院，廣西 南寧 530000)

土壤微生物是森林地下生態(tài)系統(tǒng)的重要生物驅(qū)動力之一[1]，對土壤肥力演變，尤其是養(yǎng)分循環(huán)具有重要意義[2]。土壤微生物對所生存的微環(huán)境變化十分敏感，因此土壤微生物群落特性常被用作土壤環(huán)境質(zhì)量評價和早期預測的敏感生物指標[3]。土壤微生物多樣性是評價微生物群落特征的重要內(nèi)容，反映土壤微生物功能多樣性的指標通常包括土壤微生物活性和微生物群落代謝多樣性[4]。土壤微生物在生長代謝活動過程中會釋放酶，酶的活性、種類和含量不僅可以反映微生物的代謝活性及其對營養(yǎng)元素的需求狀況，還可以反映出土壤中物質(zhì)循環(huán)和能量流動的狀態(tài)[5]，因此土壤酶活性是分析土壤微生物群落功能的另一個潛在指標，結合土壤微生物群落功能多樣性和土壤酶活性能更全面地反映整個微生物群落功能特征。

由于林分環(huán)境因子復雜，土壤微生物特征的變化受植物與土壤協(xié)同作用的影響[6]。目前，針對土壤微生物群落功能與植物群落間關系的研究越來越多[7-11]，但對土壤微生物群落特性與林分結構相關關系的研究鮮見報道。林分的水平結構和垂直結構直接決定著林下的光照、降水、溫度及林內(nèi)微環(huán)境[12]，會對植被生長和恢復產(chǎn)生重要影響，同時林分結構在調(diào)節(jié)關鍵生態(tài)系統(tǒng)過程方面也發(fā)揮著重要的作用[13]，深入系統(tǒng)地探討土壤微生物群落功能特性與林分結構的關系，有助于進一步揭示森林生態(tài)系統(tǒng)退化、恢復的機理，從而為土壤質(zhì)量監(jiān)測、植被恢復評價和可持續(xù)生態(tài)系統(tǒng)的建設提供科學依據(jù)。

在過去幾十年，中國西南喀斯特地區(qū)南盤江流域的森林經(jīng)歷了大規(guī)模的“拔大毛”式的采伐、耕地侵占、盜伐、割皮、割松脂、放牧等干擾，致使原始森林遭受了嚴重的破壞，后期通過長時間實施封育措施形成了次生林[14-16]。以細葉云南松為建群種的松櫟混交林是南盤江流域亞熱帶次生林的典型代表，對該區(qū)域水土保持、水源涵養(yǎng)和生物多樣性保護等方面發(fā)揮著關鍵作用[17]。本研究以3種不同類型的細葉云南松次生林為對象，分析其林分結構特征、土壤酶活性和土壤微生物群落碳源利用特征，較為系統(tǒng)地闡明不同類型松櫟混交林的土壤酶活性和微生物功能多樣性的變化特征，探索影響土壤微生物群落特征的主要林分結構因子。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

細葉云南松(Pinusyunnanensisvar.tenuifolia)僅分布于南盤江下游兩岸海拔300～1 600 m的丘陵山地，屬于微域分布的植被類型，廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區(qū)(106°11′31″-106°27′04″E，24°44′16″-24°53′58″N)西靠南盤江(圖1)，細葉云南松分布較多且保存相對完整。保護區(qū)屬于典型的喀斯特巖溶地貌區(qū)，濕熱同季，年平均氣溫16.8～20.4 ℃，年均降水量941～1 217 mm，降水偏少且集中分布于5-8月，年均相對濕度80%左右，年均霜日8～9 d，全年日照時數(shù)1 200～1 500 h，屬于典型的亞熱帶季風氣候區(qū)。土壤以紅壤、黃壤和石灰?guī)r發(fā)育的石灰土為主，土層較薄，通氣性及透氣性能良好，富含有機質(zhì)及其他營養(yǎng)物質(zhì)(N、P、K、Ca等)。保護區(qū)內(nèi)森林格局以常綠和落葉種群混生為主，常見樹種有：細葉云南松、栓皮櫟(Quercusvariabilis)、青岡櫟(Cyclobalanopsisglauca)、鐵堅油杉(Keteleeriadavidiana)、水錦樹(Wendlandiauvariifolia)、小果珍珠花(Lyoniaovalifoliavar.elliptica)、南燭(Vacciniumbracteatum)、二葉列柃(Euryadistichophylla)、鹽膚木(Rhuschinensis)等。廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區(qū)也是全國蘭科植物種類最豐富、分布最密集的區(qū)域。

1.2 樣地調(diào)查

據(jù)廣西國有雅長林場記載，南盤江流域細葉云南松原始林在20世紀60～90年代受到嚴重干擾后，在無人干擾條件下經(jīng)長時間自我恢復形成的次生林主要以松櫟混交林為主[18]。2016年春在廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區(qū)內(nèi)選取3種保存相對完整、樹種組成不同的細葉云南松天然次生混交林作為研究對象，分別為細葉云南松和多種闊葉樹混交林(PYⅠ)、細葉云南松和櫟類混交林(PYⅡ)、細葉云南松和鐵堅油杉及櫟類混交林(PYⅢ)(表1)，在3種混交林中分別沿對角線在上、中、下坡設置3個20 m×30 m樣方，采用全站儀內(nèi)置的“偏心模式”程序精確定位樣方內(nèi)所有活樹(喬木、灌木)的相對坐標(x,y,z)，并對所有胸徑大于5 cm的喬木進行每木檢尺，記錄所有樹木的樹種名稱、胸徑、樹高、冠幅和健康狀況等，同時，對樣方的立地環(huán)境[16]進行了詳細調(diào)查。

1.3 林分結構因子測定

從植物多樣性、林分空間結構及非空間結構3個方面對林分因子進行了分析，其中，植物多樣性的測度因子主要為物種豐富度指數(shù)(T_R)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(T_H′)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(T_D)、Pielou均勻度指數(shù)(T_J)[19]；林分空間結構因子主要有林分平均混交度(M)、角尺度(W)、大小比數(shù)(U)、開敞度(Ki)及競爭指數(shù)(Ci)[19-20]；非空間結構因子主要有林分平均胸徑(DBH)、樹高(H)、郁閉度(CC)、冠幅(CW)及株數(shù)密度(N)。

1.4 土壤樣品采集及測定

相關研究發(fā)現(xiàn)，不同土層(0～10 cm和10～20 cm)土壤環(huán)境存在明顯差異，這勢必會影響土壤微生物群落的垂直分布[21]。本研究在每個20 m×30 m的樣方內(nèi)，沿雙對角線隨機設置5個土壤取樣點，在移除凋落物后，使用內(nèi)徑為8 cm的土鉆分0～10 cm(A層)、10～20 cm(B層)2層取樣，然后將同一樣方內(nèi)5個取樣點同一土層的土壤樣品混合，置于滅菌的自封袋內(nèi)，采用冰袋保鮮的方式帶回實驗室。移除植物根系和石塊后，將樣品過2 mm篩，置于4 ℃冰箱中保存，用于土壤微生物群落特性的測定。

土壤酸性磷酸酶用4-氨基氮替比林液和鐵氰化鉀比色法測定；土壤脲酶采用苯酚鈉比色法測定；土壤過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定；土壤蔗糖酶采用3,5二硝基水楊酸比色法測定[22]。

土壤微生物功能多樣性用Biolog Eco微平板方法測定，接種操作參考宋賢沖等[8]的方法。將接種好的Biolog Eco微孔板置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每隔24 h利用多功能酶標儀(Synergy H4，美國)測定各個生態(tài)板孔在590 nm波長下的吸光度值，連續(xù)培養(yǎng)192 h。

通過計算每孔顏色平均變化率(average well-color development，AWCD公式中用AWCD表示)來反映土壤微生物利用單一碳源的能力，計算公式如下。

AWCD=∑(Ci-Ri)/n

(1)

式中：Ci為每個有培養(yǎng)基孔的吸光值，Ri為對照孔的吸光值，n為培養(yǎng)基孔數(shù)。

Biolog-Eco板有96孔，3組平行，每組31種碳源加1個空白對照，按照化學基團性質(zhì)，細分為碳水化合物類、多聚物、氨基酸類、胺類、羧酸類、酚酸類6類碳源。

用培養(yǎng)120 h的吸光值計算土壤微生物群落豐富度指數(shù)(M_R)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(M_H′)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(M_D)、Pielou均勻度指數(shù)(M_J)來表征土壤微生物功能多樣性指數(shù)[10]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

在SPSS 19.0軟件中采用雙因素方差分析林分類型和不同土層深度及其交互作用對土壤微生物功能多樣性因子的影響。采用單因素方差檢驗不同林分土壤微生物功能多樣性因子差異顯著性，并利用LSD法進行多重比較(P<0.05)。上述繪圖利用Sigmaplot 10.0軟件完成。在CANOCO 4.5軟件中運用蒙特卡洛檢驗方法對影響土壤微生物功能多樣性的林分因子進行顯著性檢驗，同時利用冗余分析對單個土壤微生物多樣性因子與林分因子的相關性進行分析，并完成繪圖。所有數(shù)據(jù)在進行冗余分析之前均經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換。

2 結果與分析

2.1 林分因子

從喬木層植物多樣性指標看，Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、豐富度和Pielou指數(shù)均表現(xiàn)為PYⅡ較高，PYⅢ較低，且PYⅡ與PYⅢ的差異均達到了顯著水平(P<0.05)。林分非空間結構因子中，PYⅠ的平均胸徑、平均樹高和冠幅均低于PYⅡ和PYⅢ，但其郁閉度和株數(shù)密度高于PYⅡ和PYⅢ。從空間結構來看，不同林分類型混交度和大小比數(shù)排序由大到小為PYⅡ、PYⅠ、PYⅢ，角尺度和競爭指數(shù)的排序由大到小為PYⅠ、PYⅡ、PYⅢ，而開敞度的排序由大到小為PYⅡ、PYⅢ、PYⅠ(表1)。

表1 3種針闊混交林的林分結構因子特征

2.2 土壤酶活性

林分類型和土層深度都顯著影響了酸性磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶和蔗糖酶活性(P<0.05)(表2)，但二者的交互作用對4種酶的活性均未產(chǎn)生顯著影響。不同類型次生混交林中4種酶的活性均表現(xiàn)出A層顯著高于B層。其中，酸性磷酸酶酶活性A、B 2層由大到小均表現(xiàn)為PYⅢ、PYⅠ、PYⅡ；而脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶酶活性A層均由大到小表現(xiàn)為PYⅢ、PYⅡ、PYⅠ，B層由大到小則是PYⅡ、PYⅢ、PYⅠ(表2)。

表2 3種針闊混交林的土壤酶活性方差分析(均值±標準差，n=3)

2.3 土壤微生物群落代謝活性變化特征

不同針闊混交林的AWCD值均隨著培養(yǎng)時間的延長而提高(圖2)，在培養(yǎng)起始的24 h內(nèi)，土壤微生物代謝非常微弱，AWCD值變化不明顯，24 h后進入快速增長期一直延續(xù)至120 h時，120 h后增速減緩并逐漸趨于穩(wěn)定。整個培養(yǎng)過程中，土壤微生物對碳源的利用程度都整體表現(xiàn)為A層高于B層，同一土層不同針闊混交林間土壤微生物對碳源利用程度也存在一定的差異，A層由大到小表現(xiàn)為：PYⅢ、PYⅡ、PYⅠ；B層由大到小則為PYⅡ、PYⅠ、PYⅢ。

2.4 土壤微生物對6類碳源利用特征

林分類型顯著影響了土壤微生物對6類碳源的利用，除胺類碳源外，土壤微生物對其他5種碳源的利用也顯著受到了土層深度的影響(表3)。6類碳源中，氨基酸、碳水化合物和羧酸類碳源是3種針闊混交林土壤微生物利用的主要碳源(圖3)，其中對氨基酸和碳水化合物類碳源的利用量A層PYⅢ顯著高于PYⅠ和PYⅡ，B層PYⅡ顯著高于PYⅠ和PYⅢ；對羧酸類碳源的利用量A層和B層都為PYⅡ較高，PYⅠ較低。從土層深度對比來看，土壤微生物對碳水化合物、氨基酸、羧酸類、多聚物、酚酸等5類碳源的利用量A層均顯著高于B層。

表3 林分類型和土層深度及交互作用對土壤微生物利用碳源的影響

2.5 土壤微生物功能多樣性指數(shù)特征

林分類型和土層深度均顯著影響土壤微生物群落的豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和均勻度指數(shù)，但二者的交互作用對4個指數(shù)無顯著影響(表4)。4個指數(shù)中，豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)變化趨勢相似，A層顯著高于B層，且在兩層都表現(xiàn)為：PYⅡ和PYⅢ無顯著差異，二者均顯著高于PYⅠ。均勻度指數(shù)B層顯著高于A層，A層PYⅡ顯著高于PYⅠ和PYⅢ，B層3種針闊混交林無顯著差異(圖4)。

表4 林分類型和土層深度及交互作用對微生物功能多樣性影響

2.6 林分結構因子與土壤微生物功能多樣性相關關系

利用土壤微生物功能多樣性各指標和林分結構因子進行冗余分析，結果顯示：A土層第一和第二軸分別能解釋土壤微生物功能多樣性與林分結構關系變異的62.0%和29.6%，B土層第一和第二軸分別能解釋土壤微生物功能多樣性與林分結構關系變異的53.6%和32.4%(圖5)。Monte Carlo置換檢驗表明，對A土層土壤微生物功能多樣性影響顯著的主要林分結構因子有林木株數(shù)密度(P=0.002)、林木開敞度(P=0.004)、林木競爭指數(shù)(P=0.004)、冠幅(P=0.008)、胸徑(P=0.01)、樹高(P=0.01)、林木角尺度(P=0.012)、郁閉度(P=0.024)；而對B土層土壤微生物功能多樣性影響顯著的主要為喬木層植被Shannon-Wiener指數(shù)(P=0.002)、林木混交度(P=0.002)、林木密度(P=0.004)、喬木層植被Pielou指數(shù)(P=0.01)、樹高(P=0.014)、喬木層物種豐富度(P=0.014)、郁閉度(P=0.036)、林木大小比數(shù)(P=0.038)。

通過土壤微生物功能多樣性各指標與單個林分結構因子相關關系的排序可以發(fā)現(xiàn)(圖5)，A土層中，土壤微生物功能均勻度指數(shù)、羧酸類碳源的利用量、脲酶活性、過氧化氫酶活性與株數(shù)密度、競爭指數(shù)、林分平均胸徑密切相關；蔗糖酶活性與林分開敞度、平均冠幅、郁閉度密切相關；酚酸碳源利用量與林分平均樹高、平均角尺度密切相關。B土層中，多聚物、碳水化合物、胺類碳源的利用量與4個喬木層植被多樣性指數(shù)均具有密切相關關系；4個微生物功能多樣性指數(shù)級氨基酸、羧酸類碳源的利用量均與郁閉度密切相關。

3 結論與討論

PYⅡ林分類型中喬木層植被Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)均高于PYⅠ和PYⅢ，這是由于PYⅠ和PYⅢ地勢較為平坦，周圍人為活動干擾了植物群落以及多樣性[17]，而PYⅡ位于山頂，無人為干擾，因此植物多樣性更高。在林分非空間結構因子中，PYⅠ郁閉度和株數(shù)密度較大，導致其平均胸徑、平均樹高和冠幅均低于PYⅡ和PYⅢ，因為林分密度越大，林木個體之間地下營養(yǎng)以及地上光照競爭等更為激烈，這些競爭關系在一定程度上限制林內(nèi)樹木個體生長，相反地，林分密度小則更有利于林木生長[23]。從空間結構來看，PYⅠ林分林木空間分布格局總體呈團狀分布(W>0.517)，PYⅡ和PYⅢ總體則呈隨機分布(W為0.475～0.517)[24]。3種針闊混交林混交度平均值均以PYⅡ高于PYⅠ和PYⅢ，PYⅠ中由于小果珍珠花株數(shù)占比較大，存在本種相鄰的現(xiàn)象導致混交度較低；而PYⅢ主要是在經(jīng)營過程中為了促進鐵堅油杉和栓皮櫟的更新，出現(xiàn)擇伐作業(yè)，導致優(yōu)勢樹種數(shù)量較多而呈現(xiàn)的一些單種聚集分布現(xiàn)象影響了林分整體混交度。3種混交林大小比數(shù)平均值差異較小，這是由不同生長狀態(tài)的林木株數(shù)比例較小引起，導致林木之間的競爭不激烈[25]，與我們的林木競爭關系分析結果一致(表1)。

3種針闊混交林土壤酶活性、微生物活性和功能多樣性都存在差異。研究結果顯示，針葉落葉占比較大的PYⅠ林分過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性小于其他2種混交類型，因為針葉林有機質(zhì)通常低于闊葉林[26]，為微生物生長提供底物更少[27]，該林分中外生菌根類松屬植物通過分泌胞外酶獲取有機質(zhì)中的可溶性有機氮[28]，致使營腐生的自由微生物可利用底物數(shù)量和質(zhì)量降低[29]；其次，PYⅠ的上層郁閉度較大，減少可到達地面的光照和土壤水分，減弱土壤微生物活動[30]，從而抑制微生物的生長和繁殖。因此，PYⅠ林分需要通過提高過氧化氫酶、蔗糖酶活性促進土壤有機質(zhì)分解[31]，通過脲酶促進土壤氮素轉(zhuǎn)化[32]。此外，土壤磷酸酶影響土壤碳、氮、磷的轉(zhuǎn)化與循環(huán)[32]，其活性常與土壤有效P質(zhì)量分數(shù)呈負相關關系[33]，PYⅢ土壤酚酸含量顯著高于其他2種類型，有利于刺激土壤微生物釋放磷酸酶[34]，導致該林分類型中磷酸酶活性高于其他2種林分。研究結果還表明土層顯著影響土壤酶活性，土壤表層存在較多凋落物，腐殖質(zhì)含量多，且含有較多的微生物、植物、動物以及有機殘體等，較多種類的土壤動物、微生物、植物使得其生理活性增加，釋放的酶會增加[35]，導致不同針闊混交林中酸性磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶和蔗糖酶活性隨著土層的加深逐漸降低，這與大多數(shù)研究結果一致[36]。

3種針闊混交林土壤微生物利用量較高的碳源類型均是氨基酸和碳水化合物，和針葉類或針闊類樹種土壤微生物利用碳源種類的結果一致[37-38]。研究地處于南亞熱帶，土壤高度風化和酸化[39]，硝化作用增強，使土壤中NH4+含量大都遠高于NO3-，形成以NH4+占絕對優(yōu)勢的“氮營養(yǎng)生境”[40]。針葉樹種長期所處NH4+優(yōu)勢生境將會產(chǎn)生充分適應性，表現(xiàn)出典型的“喜銨性”[40]，在喜銨的針葉樹種根部含有大量能將游離NH4+轉(zhuǎn)化成氨基酸的酶類，如谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脫氫酶等[41]，這些酶類的存在能使土壤中的NH4+轉(zhuǎn)化成氨基酸[42]，從而為微生物提供了大量氨基類碳源，該結果解釋了本研究針闊混交林中氨基酸更多被土壤微生物利用。研究結果還發(fā)現(xiàn)羧酸類碳源的利用量、脲酶活性、過氧化氫酶活性與林分平均胸徑成正相關，即微生物活性越強，越有利于提高林木胸徑的增長[43]，但當株數(shù)密度較大時，胸徑大小顯著降低[44]。土壤微生物功能多樣性同樣受株數(shù)密度顯著影響，株數(shù)密度越大，郁閉度越高，微生物功能多樣性指數(shù)增加[45]，但其會降低氨基酸、羧酸類碳源的利用量。由此可見，植被-土壤-微生物三者之間的相互作用，是促進退化森林恢復的重要因素[8]。然而，自然恢復過程中侵入樹種雜亂，林分株數(shù)密度增大，導致水熱以及光照、土壤營養(yǎng)競爭激烈，直接影響或間接通過土壤微生物活動影響樹高、胸徑和郁閉度等因子[23]。由于樹種間競爭并逐步淘汰所需時間長，因此，森林生態(tài)恢復過程中仍需采取人工促進措施，對種類組成與密度進行適度調(diào)控，改善林分結構及立地環(huán)境，以加速恢復退化的森林。