枸杞子標準湯劑制備及質(zhì)量標準研究

黃燕明，陳桂生，李雪銀，汪 靜，王艷慧，康志英，2，3

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300；3.廣東香雪南藥發(fā)展有限公司，廣東 肇慶 526600)

中藥配方顆粒也稱“免煎中藥”，由于它具有攜帶方便、使用便捷的特點，已被廣泛應(yīng)用于臨床并初步顯現(xiàn)出較好的臨床療效。作為一種新型飲片，配方顆粒具有簡便的特點，其質(zhì)量問題也備受關(guān)注。為了使配方顆粒的質(zhì)量評價更規(guī)范化，業(yè)界引入了“標準湯劑”這一概念。中藥飲片標準湯劑也稱標準煎劑，以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，經(jīng)標準化的現(xiàn)代制備工藝制備而成的單味飲片煎劑，用于衡量配方顆粒的標準參照物[1]。

枸杞子，別名紅耳墜、地骨子，為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實[2]。枸杞子屬于常用的滋補類中藥，也是藥食兩用品種，具有補益肝腎、益精明目的功效，適用于有虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴等癥狀的人群[2-3]。查閱文獻可知，枸杞子主要含有枸杞多糖、生物堿、黃酮類、氨基酸、色素、有機物酸類等化學(xué)成分[4-6]。為科學(xué)評價枸杞子配方顆粒質(zhì)量，本研究通過收集15批來自不同產(chǎn)地的枸杞子飲片，依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》，結(jié)合《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中藥煎煮方法相關(guān)操作規(guī)范要求，分別制備成15批枸杞子飲片標準湯劑，計算出膏范圍，進行指紋圖譜研究，并對共有峰進行指認，建立枸杞子飲片標準湯劑質(zhì)量標準評價方法，進一步為枸杞子配方顆粒質(zhì)量評價提供參考依據(jù)[7-10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(安捷倫)；DV215CD十萬分之一天平(Discovery)；BSA224S萬分之一天平(Sartorius)；LC-20AD高效液相色譜(SHIMADZU)，連接AB-5500型三重四級桿-離子阱質(zhì)譜儀(Q-Trap-MS)；配兩個獨立二元泵、可控溫自動進樣器、可控溫柱溫箱、光電二極管陣列檢測器(PDA)和電噴霧離子源(ESI)。DK-80型三孔電熱恒溫水箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

乙腈(天津賽孚瑞，色譜純)，甲醇(北京化工廠，分析純)，甲酸(北京化學(xué)試劑廠，分析純)，磷酸(西隴化工，分析純)，超純水。

1.3 對照品

蘆丁對照品(批號：100080-201409；純度：供HPLC 91.9%；供UV 92.6%)，購自中國食品藥品檢定研究院。枸杞子對照藥材(批號：121072-201410)，購自中國食品藥品檢定研究院。綠原酸對照品(批號：110753-201817；純度：96.8%)，購自中國食品藥品檢定研究院。對-香豆酸對照品(批號：112037-201801；純度：99.3%)，購自中國食品藥品檢定研究院。阿魏酸對照品(批號：110773-201915；純度：99.4%)，購自中國食品藥品檢定研究院。咖啡酸對照品(批號：110885-201703；純度：99.7%)，購自中國食品藥品檢定研究院。隱綠原酸酸對照品(批號：19042402；純度：98.03%)，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。新綠原酸對照品(批號：19042305；純度：99.60%)，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

1.4 樣品

本研究共收集來自3個不同產(chǎn)地的15批枸杞子飲片，樣品經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司高級工程師康志英鑒定均為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實。飲片產(chǎn)地信息見表1。

表1 枸杞子飲片產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 標準湯劑制備

稱取枸杞子飲片100 g，加水煎煮2次，第一次加12倍量水，浸泡30 min，煎煮40 min，濾過；藥渣加10倍量水，煎煮30 min，濾過，合并濾液，減壓濃縮至生藥濃度約為1∶2(g∶mL)的浸膏，冷凍干燥，即得。

2.2 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加50%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.1.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加50%乙醇至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加50%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在510 nm波長處測定吸光度。

2.1.3 測定法 取枸杞子凍干粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液3 mL，置25 mL量瓶中，照標準曲線的制備項下的方法，自“加50%乙醇至6.0 mL”起，以自身為空白，依法測定吸光度。

2.1.4 方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系。稱取蘆丁對照品(批號：100080-201409，純度UV：92.6%)20.68 mg，置量瓶中，加50%乙醇適量使溶解，放冷，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.191 5 mg·mL-1的對照品溶液。精取對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加50%乙醇至6.0 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加50%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)溶劑為空白，在510 nm的波長處分別測定吸光度，繪制標準曲線?；貧w方程：Y=12.881 5x+0.038 131 4，相關(guān)系數(shù)：r=1.000 0。結(jié)果表明，蘆丁在0.007 66～0.045 96 mg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

(2)準確度試驗。取枸杞子標準湯劑凍干粉，批號：200101，總黃酮含量以蘆丁計為0.813%。采用加樣回收法，精密稱取蘆丁對照品47.96 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙醇超聲溶解，取出，放冷，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.888 2 mg/mL的對照品溶液。分別取6份枸杞子標準湯劑約0.5 g，精密稱定，分置具塞錐形瓶中，精密量取上述蘆丁對照品溶液5 mL，再精密加入50%乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取上述續(xù)濾液3 mL，置25 mL量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自“加50%乙醇至6.0 mL”起，依法測定吸光度。結(jié)果總黃酮平均回收率為102.39%，RSD為0.79%，表明本方法準確度較好。

(3)樣品測定。取15批枸杞子凍干粉依法測定，計算總黃酮的轉(zhuǎn)移率和出膏率，結(jié)果見表2。

表2 15批枸杞子標準湯劑總黃酮含量與出膏率測定結(jié)果 (%)

2.3 指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.5%甲酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫程序見表3；檢測波長為330 nm。理論板數(shù)按蘆丁峰計算應(yīng)不低于10 000。

表3 洗脫程序

2.3.2 參照物溶液的制備 取枸杞子對照藥材約3 g，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加入80%乙醇50 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水適量溶解，加在聚酰胺柱上(60～100目，內(nèi)徑1.5 cm，高5 cm，用水處理至中性)，先用水150 mL洗脫，棄去水液，繼用30%乙醇溶液100 mL洗脫，棄去30%乙醇液，再用50%乙醇溶液100 mL洗脫，收集50%乙醇洗脫液，濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材參照物溶液。另取蘆丁對照品適量，精密稱定，加50%乙醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取枸杞子凍干粉約6 g，置具塞錐形瓶中，加入80%乙醇50 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水適量溶解，加在聚酰胺柱上(60目～100目，內(nèi)徑1.5 cm，高5 cm，用水處理至中性)，先用水150 mL洗脫，棄去水液，繼用30%乙醇溶液100 mL洗脫，棄去30%乙醇液，再用50%乙醇溶液100 mL洗脫，收集50%乙醇洗脫液，濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 樣品檢測結(jié)果 取15批枸杞子凍干粉，依法制備供試品溶液并測定，得到15批枸杞子標準湯劑的色譜疊加圖(見圖1)，生成對照指紋圖譜(見圖2)。采用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》對15批樣品的色譜圖進行分析，相似度大于0.90。以相對保留時間穩(wěn)定性好且各批次樣品均有檢出為原則，選出5個共有峰。

圖1 15批標準湯劑HPLC疊加圖

注：峰1：綠原酸；峰2：隱綠原酸；峰3：對-香豆酸；峰4：阿魏酸；峰5(S)：蘆丁。

2.3.5 方法學(xué)考察 (1)精密度試驗。取同一供試品溶液(批號：200101)，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，每次10 μL，記錄圖譜。所得圖譜按《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》對其相似度進行計算，結(jié)果相似度均在0.98以上，RSD為0.00%，表明儀器精密度良好。

(2)重復(fù)性試驗。分別稱取6份枸杞子凍干粉(批號：200101)，按供試品溶液制備和測定法項下進行操作，記錄圖譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》評價，結(jié)果圖譜相似度均在0.98以上，RSD為0.31%，表明該方法的重復(fù)性良好。

(3)穩(wěn)定性試驗。取同一份枸杞子標準湯劑供試品溶液，放置0、2、4、6、8、12、24h后進樣分析，記錄圖譜。各圖譜相似度評價均在0.98以上，RSD為0.04%，說明供試品溶液在放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(4)耐用性試驗?？疾觳煌魉?1.0 mL·min-1、1.1 mL·min-1、1.2 mL·min-1)、不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、不同色譜柱對本色譜條件的耐用性，所得圖譜分別以共有峰計算相似度，結(jié)果不同色譜柱、不同流速、不同柱溫條件下測定結(jié)果差異不大，色譜圖中各共有峰峰型尖銳、對稱，分離度良好，相似度均不低于0.90，RSD均<3%。表明本方法不同色譜柱、不同流速、不同柱溫條件下耐用性良好。

2.4 共有峰指認

采用HPLC-Q-TOF-MS法確認枸杞子標準湯劑共有峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.4.1 供試品溶液的制備 同“2.3.3”項下供試品溶液制備方法。

2.4.2 色譜分離條件 同“2.3.1”項下的色譜條件。

2.4.3 質(zhì)譜條件 分別在正、負離子模式下進行檢測，干燥氣溫度設(shè)定為600 ℃，干燥氣流速為35 L/min，霧化氣壓力60 psi，毛細管電壓5 500 V(正模式)和4 500 V(負模式)，祛簇電壓100 V。一級質(zhì)譜選用EMS模式，質(zhì)量掃描范圍50～1 000m/z。二級質(zhì)譜選用EPI模式，碰撞電壓30 eV。

2.4.4 質(zhì)譜分析與結(jié)果 精密吸取枸杞子標準湯劑供試品溶液注入LC-MS儀，按上述條件進行檢測，根據(jù)枸杞子標準湯劑供試液的HPLC-UV色譜圖(見圖3)和HPLC-QTrap-MS總離子流圖，9個色譜峰物質(zhì)均得到了良好的分離和檢測。枸杞子標準湯劑指紋圖譜中9個色譜峰的一級、二級質(zhì)譜分析結(jié)果見表4[11-16]。

圖3 枸杞子標準湯劑供試液的HPLC-UV色譜

表4 一級和二級質(zhì)譜分析結(jié)果

續(xù)表4

根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果，結(jié)合參考文獻進行比對分析，確認9個色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)，依次為綠原酸、隱綠原酸、對-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、新綠原酸、咖啡酸、1，3，5-三咖啡?？鼘幩?、3，4，5-三咖啡酰奎寧酸，其中峰S3和峰S4互為異構(gòu)體(1，3，5-三咖啡酰奎寧酸/3，4，5-三咖啡?？鼘幩?。在研究中筆者發(fā)現(xiàn)，峰S1～S4在多批次中波動較大，故不定為共有峰。

3 討論

枸杞子的活性成分主要含有多糖、黃酮類，其中黃酮類已知成分主要有蘆丁等，所以指紋圖譜中供試品制備方法考察中考慮聚酰胺柱處理的方法。本試驗還分別考察不同內(nèi)徑層析柱及聚酰胺用量(內(nèi)徑1 cm，高20 cm；內(nèi)徑1.5 cm，高10 cm；內(nèi)徑1.5 cm，高5 cm)對圖譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)層析柱不同內(nèi)徑及聚酰胺用量均無較大區(qū)別。從節(jié)省時間角度考慮，供試品制備方法采用聚酰胺柱(60～100目)，內(nèi)徑1.5 cm，高5 cm，用水處理至中性。

本研究通過制備15批枸杞子標準湯劑，并進行總黃酮含量檢測，計算轉(zhuǎn)移率和出膏率，同時建立其指紋圖譜檢測方法，并進行方法學(xué)考察。其中總黃酮含量測定方法學(xué)線性良好，準確度試驗RSD小于3%；指紋圖譜精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性試驗RSD亦均小于3%，表明兩個方法均穩(wěn)定可行，可作為枸杞子標準湯劑質(zhì)量評價方法，同時為枸杞子配方顆粒質(zhì)量評價提供參考。