不同提取方式對(duì)冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影響

胡 楊，李先芝，2*，石 豪，劉 洋，毛瓊麗，嚴(yán) 玲

(1.勁牌有限公司，湖北 大冶 435112；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 大冶 435112 )

冬葵果為錦葵科植物冬葵(MalvaverticillataL.)的干燥成熟果實(shí)，一般于夏、秋季節(jié)果實(shí)成熟時(shí)采收，除去雜質(zhì)，陰干，冬葵果藥材外表黃綠色或黃棕色，具有清熱利尿、消腫之功效[1]，該藥作為蒙古族常用藥，在我國(guó)具有悠久應(yīng)用歷史。有研究表明，冬葵果中含有揮發(fā)油、多糖、酚酸、黃酮等有效成分[2-5]，而咖啡酸、阿魏酸是冬葵果中主要的酚酸類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，咖啡酸、阿魏酸等酚酸類具有抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、護(hù)肝、抗癌等生物活性[6-13]，因此對(duì)冬葵果進(jìn)行深加工，并對(duì)其有效藥用成分進(jìn)行提取，具有廣闊的開發(fā)利用前景。

《中國(guó)藥典》是通過測(cè)定冬葵果中的總酚酸含量對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制，但只介紹了紫外分光光度法，而應(yīng)用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定冬葵果中的咖啡酸、阿魏酸的含量未見報(bào)道。本研究以冬葵果為原料，分別采用水煮法、醇提法、超聲提取法、索氏提取法等幾種常見提取方法對(duì)冬葵果中咖啡酸、阿魏酸進(jìn)行提取，并以HPLC法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，以期找到一種簡(jiǎn)單且有效的提取方法，為冬葵果的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(賽默飛公司，uLtiMate 3000，美國(guó))；電子分析天平(賽多利斯SQP，德國(guó))；數(shù)控超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，中國(guó))；PURELAB-超純水儀(PURELAB classic UV，英國(guó))；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司，中國(guó))；索氏提取器(SXT-06，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司，中國(guó))。

1.1.2 試劑 乙腈(HPLC級(jí)，美國(guó)費(fèi)希爾公司)；磷酸(HPLC級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)有限公司)；乙醇(國(guó)藥集團(tuán)有限公司，分析純)；水為超純水；其他試劑均為分析純。對(duì)照品：咖啡酸(批號(hào)：110885-201703，純度99.7%，中國(guó)藥品檢定研究院)，阿魏酸(批號(hào)：110773-201313，純度99.6%，中國(guó)藥品檢定研究院)。冬葵果樣品由勁牌持正堂藥業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 水煮法 準(zhǔn)確稱取冬葵果粉末0.5 g置錐形瓶中，精密加入蒸餾水20 mL，于80 ℃條件下回流1 h，放冷，用蒸餾水補(bǔ)足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.2 醇提法 準(zhǔn)確稱取冬葵果粉末0.5 g置加熱回流裝置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃條件下回流3 h，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.3 超聲提取法 準(zhǔn)確稱取冬葵果粉末0.5 g置錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，在250 W、35 kHz、90 ℃條件下超聲30 min，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.4 索氏提取法 準(zhǔn)確稱取冬葵果粉末0.5 g置索氏提取裝置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃條件下回流3 h，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.5 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫見表1；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm。在此色譜條件下記錄色譜圖。

表1 冬葵果檢測(cè)流動(dòng)相洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 水煮法條件的確定

因咖啡酸與阿魏酸均溶于熱水，故本研究對(duì)時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化，選取不同的提取時(shí)間和提取溫度依次進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度上升時(shí)，咖啡酸、阿魏酸含量也隨之增加，但當(dāng)溫度相同時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)咖啡酸的含量逐漸降低，而阿魏酸含量逐漸增加。這可能是由于咖啡酸結(jié)構(gòu)中含有不飽和雙鍵，在水煮條件下容易被氧化，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)冬葵果粉與水分子間的吸附作用被破壞，阿魏酸被釋放出來[14-15]。綜合考慮，選擇編號(hào)2，提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為1 h，可達(dá)到綜合較優(yōu)的效果。見表2、圖1。

2.2 醇提法條件的確定

由于咖啡酸和阿魏酸含有較多的親水基，故其可溶于水或者親水的有機(jī)試劑如乙醇。而乙醇是較常用的提取溶劑，故醇提法選擇乙醇作為提取溶劑。為了達(dá)到最佳的提取效果，本研究采用正交試驗(yàn)對(duì)乙醇比例、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素分別進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，見表3。通過正交試驗(yàn)結(jié)果分析，結(jié)果顯示提取溶劑乙醇的比例對(duì)咖啡酸和阿魏酸的提取效果影響最大，R分別為0.221 2、0.044 7；而提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響最小，R分別為0.057 4、0.016 2。綜上，編號(hào)3的提取效果最佳，咖啡酸和阿魏酸含量分別為0.193 6 mg/g、0.029 4 mg/g。故最終選擇的提取條件為乙醇比例為50%、提取時(shí)間為3 h、提取溫度為90 ℃。見表3、表4。

2.3 不同提取方式對(duì)咖啡酸、阿魏酸含量的影響

在確定了提取溶劑的比例、提取時(shí)間、提取溫度的情況下，將不同提取方式對(duì)冬葵果中咖啡酸、阿魏酸的提取效果進(jìn)行了比較，結(jié)果見表5。由表5可知，醇提法相對(duì)于其他方法而言具有較大的優(yōu)勢(shì)。因此，選擇醇提法作為最終提取方法。

表2 不同提取條件對(duì)冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影響

圖1 同一溫度不同時(shí)間對(duì)冬葵果中 咖啡酸、阿魏酸含量的影響

表3 試驗(yàn)因素水平

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精確稱取咖啡酸8.33 mg、阿魏酸5.98 mg至20 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得咖啡酸濃度為415.250 5 mg/L、阿魏酸濃度為297.804 mg/L的混合對(duì)照品母液。

2.4.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取冬葵果粉末0.5 g置加熱回流裝置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃條件下回流3 h，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 不同提取方式對(duì)冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影響比較 (mg/g)

2.4.3 線性關(guān)系考察 將混合對(duì)照品溶液母液稀釋成5個(gè)不同濃度水平的對(duì)照品混合溶液，精密吸取5個(gè)不同濃度的對(duì)照品混合溶液10 μL，注入液相色譜儀，得到各濃度的色譜峰的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性關(guān)系及范圍。結(jié)果見表6。

表6 線性范圍

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取同一冬葵果樣品，按照“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，咖啡酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為0.42%、1.12%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一冬葵果樣品6份，按照“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，咖啡酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.61%、1.33%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一冬葵果樣品，按照“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、5、9、13、18 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，咖啡酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為0.42%、0.48%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下放置18 h穩(wěn)定性良好。

2.4.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的冬葵果樣品0.25 g至加熱回流裝置中，共9份。分別按照冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的50%、100%、150%共3個(gè)水平加入對(duì)照品適量，按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，咖啡酸、阿魏酸加樣回收率結(jié)果見表7?？Х人崤c阿魏酸的加樣回收率在93.48%～100.95%之間，RSD值小于3%。

表7 冬葵果中咖啡酸、阿魏酸的加樣回收率 (n=9)

3 結(jié)論

本研究探討不同提取方法對(duì)冬葵果中咖啡酸和阿魏酸含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用醇提法時(shí)，咖啡酸與阿魏酸的含量最高，分別達(dá)到0.193 6 mg/g、0.029 4 mg/g；其最佳提取條件為：乙醇比例50%，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間4 h。本研究通過HPLC法同時(shí)測(cè)定冬葵果樣品中咖啡酸和阿魏酸的含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可用于冬葵果藥材中咖啡酸和阿魏酸含量的檢測(cè)及質(zhì)量監(jiān)控。