基于UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)研究黃甲軟肝顆粒及其中間體物質(zhì)基礎(chǔ)

王彩云，盧敬光，朱國元，張保獻(xiàn)，姜志宏，王宗權(quán)*，高 進(jìn)2，*

(1.澳門科技大學(xué) 中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門藥物及健康應(yīng)用研究院，中國 澳門 999078；2.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；3.盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司，國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心新型遞藥系統(tǒng)分中心，廣東省霧化吸入制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 珠海 519000)

肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是一個(gè)可逆的過程，中藥在抑制肝纖維化進(jìn)展和促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)方面優(yōu)勢(shì)獨(dú)特，許多中藥已廣泛應(yīng)用于臨床，并取得了一些較好的療效[1-5]。黃甲軟肝顆粒(臨床批件號(hào)：2010L03749)處方來源于臨床，由鱉甲、靈芝、黃芪、丹參、葛根、三七、柴胡、赤芍、雞骨草、葉下珠等10味中藥組成，具有益氣疏肝、活血軟堅(jiān)、清熱利濕之功。目前，其處于Ⅱ期臨床階段，前期開展并完成了藥效學(xué)、毒理學(xué)等研究，但尚未系統(tǒng)闡述其化學(xué)成分和物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，對(duì)黃甲軟肝顆粒及其中間體中的化學(xué)成分進(jìn)行分析，建立了每味藥材的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，采用數(shù)據(jù)庫匹配、對(duì)照品驗(yàn)證的方式，對(duì)檢測(cè)到的成分進(jìn)行了鑒定和藥味歸屬，可為工藝生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制、穩(wěn)定性研究，以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草等提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

1290型超高性能液相色譜儀-6230 型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國Agilent 公司)，AUY220 型1 /1 萬電子天平(日本島津公司)，AB265-S 型1 /10 萬電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，Allegra X-15R 型離心機(jī)(美國Beckman Coulter 公司)，Milli-Q型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 材料與試劑

葛根素對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：9020922)；二氫丹參酮Ⅰ(江蘇永建醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：YJ140810)；黃芪甲苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、柴胡皂苷A、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、芍藥苷、蘆丁、芹菜素、原兒茶醛、柯里拉京、鞣花酸、靈芝酸A、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷F2對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：110781-201717、110745-201619、110703-201529、110704-201625、110777-201510、110766-201721、111562-201716、110736-201842、100080-201811、111901-201603、110810-201608、111623-201002、111959-201602、111985-201601、110754-201626、111818-201603、111764-201602)；沒食子酸、綠原酸、隱綠原酸、槲皮素、異槲皮苷、迷迭香酸、丹參素鈉、隱丹參酮、20(R)-人參皂苷Rh1對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為：MUST-16022801、MUST-12031401、MUST-12113002、MUST-16031804、MUST-15070211、MUST-12020702、MUST-12080701、MUST-12082909、MUST-14031311)；三七皂苷R2、20(S)-人參皂苷Rg2、20(R)-人參皂苷Rg2、20(S)-人參皂苷Rh1、七葉膽苷ⅩⅦ、20(S)-人參皂苷Rg3、20(R)-人參皂苷Rg3為實(shí)驗(yàn)室自制。乙腈(色譜純，廠家：ACSchem，USA)，甲酸(分析純，廠家：德國默克)，水為自制超純水。黃甲軟肝顆粒(批號(hào)：20190615)、黃甲軟肝中間體(真空減壓粉)、鱉甲粉末、靈芝粉末、黃芪粉末、丹參粉末、葛根粉末、三七粉末、柴胡粉末、赤芍粉末、雞骨草粉末及葉下珠粉末均由盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，洗脫梯度：0～20 min，3%～60%B；20 min～25 min，60%～95%B；25 min～30 min，95%B；30 min～31 min，95%～3%B；31min～35 min，3%B，流速0.35 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子模式掃描，掃描范圍m/z100～1 700，MS采樣速率2 spectra·s-1，干燥氣(N2)流速10 L·min-1，干燥氣溫度325 ℃，噴霧器壓力0.28 mPa，毛細(xì)管電壓3.5 kV，噴嘴電壓正離子模式0.5 kV、負(fù)離子模式1.5 kV，Agilent MassHunter workstation軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.2 樣品溶液制備

2.2.1 黃甲軟肝顆粒及中間體供試品溶液 精密稱取黃甲軟肝顆粒及黃甲軟肝中間體各0.1 g，分別加入50%甲醇10 mL，超聲處理(功率220 W，頻率50～60 kHz)30 min，取出，離心(4 000 r·min-1，10 min)，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 單味藥供試品溶液 分別精密稱取鱉甲、靈芝、黃芪、丹參、葛根、三七、柴胡、赤芍、雞骨草、葉下珠粗粉各0.1 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，得各單味藥供試品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液 分別取沒食子酸、丹參素、原兒茶醛、隱綠原酸、綠原酸、葛根素、柯里拉京、芍藥苷、蘆丁、鞣花酸、異槲皮苷、三七皂苷R1、迷迭香酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、槲皮素、人參皂苷Rb1、三七皂苷R2、芹菜素、20(S)-人參皂苷Rg2、20(R)-人參皂苷Rg2、20(S)-人參皂苷Rh1、20(R)-人參皂苷Rh1、黃芪甲苷、人參皂苷Rd、靈芝酸A、七葉膽苷ⅩⅦ、柴胡皂苷A、人參皂苷F2、20(S)-人參皂苷Rg3、20(R)-人參皂苷Rg3、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加甲醇超聲使溶解，冷卻至室溫后定容至刻度，搖勻，制成10 mg·L-1的對(duì)照品溶液。

2.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

結(jié)合Dictionary of Natural Products(DNP)，ChemSpider，PubChem等數(shù)據(jù)庫中質(zhì)譜信息以及參考文獻(xiàn)[6-41]，建立單味藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，采用Masshunter(B.06.00)軟件采集和處理數(shù)據(jù)，將主要色譜峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量與自建的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，推測(cè)各化合物的分子式，結(jié)合對(duì)照品和單味藥質(zhì)譜信息對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)和歸屬。

2.4 化學(xué)成分分析

黃甲軟肝顆粒及中間體供試品溶液的基峰離子色譜(BPC)見圖1、圖2。黃甲軟肝顆粒共鑒定出126個(gè)化學(xué)成分、黃甲軟肝中間體共鑒定出141個(gè)化學(xué)成分，共有峰116個(gè)，其中35個(gè)化合物有對(duì)照品驗(yàn)證，并對(duì)每個(gè)化合物的來源進(jìn)行了歸屬(見表1)。按藥材歸屬化學(xué)成分鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析見表2。

注：a.黃甲軟肝顆粒；b.黃甲軟肝中間體；c.空白。

注：a.黃甲軟肝顆粒；b.黃甲軟肝中間體；c.空白。

表1 黃甲軟肝顆粒及中間體化學(xué)成分的UHPLC-Q-TOF-MS鑒定

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

鱉甲[8-9]的主要成分為氨基酸、核苷、肽及鱉甲多糖，黃甲軟肝顆粒與中間體中未找到鱉甲的歸屬。雞骨草[10-11]藥材主要含有生物堿、蒽醌類及皂苷類等。靈芝[12-13]藥材主要含有三萜類和多糖，以及核苷類、甾醇類、生物堿類、多肽。黃甲軟肝顆粒和中間體中檢出的靈芝成分主要為三萜類。三七[14-20]藥材中主要含有皂苷類成分，皂苷類成分在弱酸弱堿低溫條件下比較穩(wěn)定，而在強(qiáng)酸高溫下受影響大，且會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，這也解釋了黃甲軟肝顆粒中一些三七皂苷成分反而在中間體中缺失的原因[8]。丹參[21-24]中有效成分主要有脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類成分，此外還含黃酮類、三萜類和甾醇類等成分。黃甲軟肝顆粒和中間體中檢出的丹參成分主要為二萜醌類和酚酸類。黃芪[23，25-26]中主要含有三萜皂苷、黃酮類化合物以及多糖。黃甲軟肝顆粒和中間體中檢出的黃芪成分主要為三萜皂苷和黃酮類。赤芍[27-28]中主要含有萜類及其苷，赤芍中各苷類的總稱為赤芍總苷，是其主要有效成分。黃甲軟肝顆粒和中間體中檢出的赤芍成分主要為單萜類。葉下珠[29-30]中包括黃酮、鞣質(zhì)、香豆素、甾體、木脂素、三萜、酚酸、有機(jī)酸等多種類型。黃甲軟肝顆粒和中間體中檢出的葉下珠成分主要為黃酮和有機(jī)酸。葛根[31-38]中主要含有異黃酮和三萜類，異黃酮是葛根的主要活性成分，包括苷和苷元。黃甲軟肝顆粒和中間體中檢出的葛根成分，主要為黃酮類。柴胡[39-41]中除含有揮發(fā)油和皂苷外，尚含有黃酮、多元醇、植物甾醇、香豆素、脂肪酸等成分。黃甲軟肝顆粒和中間體中檢出的柴胡成分主要為皂苷。此外，黃甲軟肝顆粒中檢出了阿斯巴甜輔料。

表2 黃甲軟肝顆粒及中間體按藥材歸屬化學(xué)成分鑒定結(jié)果

3 討論

(1)本研究對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了不同色譜柱、柱溫及洗脫梯度等，最后選擇Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng)，柱溫35 ℃，藥材、中間體及成品的分離效果較好，35個(gè)對(duì)照品中的同分異構(gòu)體也得到了較好的分離。

(2)黃甲軟肝顆粒復(fù)方中成分較多且響應(yīng)模式不盡相同，正離子模式適用于檢測(cè)雜原子化合物，負(fù)離子模式更適用于多羥基、羧基得到化合物，如三七皂苷類、酚酸類等。因此，本研究采用了2種離子掃描模式(ESI+和ESI-)對(duì)黃甲軟肝顆粒及中間體的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，成品共鑒定出126個(gè)化學(xué)成分、中間體共鑒定出141個(gè)化學(xué)成分，以黃酮、皂苷、酚酸、二萜醌和三萜類為主。皂苷類成分在弱酸弱堿低溫條件下比較穩(wěn)定，而在強(qiáng)酸高溫下受影響大，且會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，這也解釋了黃甲軟肝顆粒中一些三七皂苷成分反而在中間體中缺失的原因。成品中鑒定的化學(xué)成分略少于中間體，可能是工藝生產(chǎn)過程中，化合物不穩(wěn)定造成，也可能是成品中這些化合物的峰面積低于檢測(cè)限而被忽略。

(3)鱉甲的主要成分為氨基酸、核苷、肽及鱉甲多糖，核苷類是具有廣泛生理活性的一類水溶性成分，多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化及抗衰老等多方面作用。黃甲軟肝顆粒與中間體中未找到鱉甲的歸屬，這應(yīng)該與檢測(cè)方法、色譜柱的選擇有關(guān)，本研究選用的C18色譜柱因其疏水性結(jié)構(gòu)對(duì)多糖等成分保留效果較差。

(4)本研究建立了基于UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的分析方法，對(duì)中藥復(fù)方制劑黃甲軟肝顆粒及其中間體的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)合自建數(shù)據(jù)庫匹配，對(duì)照品驗(yàn)證的成分鑒定方法，所鑒別的化合物可全面反映黃甲軟肝顆粒的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對(duì)黃甲軟肝顆粒的研究開發(fā)、質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用具有重要參考意義。