基于“精華與糟粕分解”理論的幽門結(jié)扎性肝損傷病因及連翹-4保肝作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究

苓 苓，昂格力瑪，宮菊花，吳圓圓，杜 蘭，王 歡

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

幽門結(jié)扎性肝損傷模型為本課題組創(chuàng)新研究的新型肝損傷病癥模型。其理論基礎(chǔ)是基于蒙醫(yī)“三根七素”理論的“精華與糟粕分解”理論，即人體新陳代謝過程，此過程中胃和肝臟起著關(guān)鍵作用，且相互密切相關(guān)，按精華與糟粕分解順序，如前者無病變，則后者提供營養(yǎng)。幽門結(jié)扎性肝損傷模型與臨床上幽門狹窄導(dǎo)致的相關(guān)疾病相似[1]。據(jù)前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明，幽門結(jié)扎后導(dǎo)致146個(gè)蛋白出現(xiàn)顯著差異，其中上調(diào)1.5倍以上者有78個(gè)，下調(diào)1.5倍以上者有68個(gè)，其蛋白功能大部分與新陳代謝有關(guān)，部分與炎癥介質(zhì)有關(guān)，還有部分與免疫系統(tǒng)有關(guān)。通過基因芯片技術(shù)分析，有562個(gè)差異基因。其中大部分差異基因與新陳代謝有關(guān)，即藥物代謝及谷胱甘肽、過氧化物酶、膽汁酸、脂肪酸代謝等[2]。目前，尚鮮有該病癥模型病因機(jī)制研究的報(bào)道。

蒙藥連翹-4別名音達(dá)日西湯、蘇龍嘎-4湯，由連翹、麥冬、拳參、川木通等4種藥物組成。其中連翹為主藥，麥冬、拳參、川木通為輔助藥，該藥為涼性方劑，可祛熱、止瀉，主治大小腸之熱痢疾、腹痛、腹瀉等疾病[3]。目前，主要從抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腹瀉、抑菌殺菌等方面對(duì)連翹-4進(jìn)行了藥效學(xué)研究[4-7]，研究發(fā)現(xiàn)，連翹-4對(duì)諸多因素導(dǎo)致的肝損傷有很好的保護(hù)作用，如連翹-4對(duì)“幽門結(jié)扎”性肝損傷和CCl4引起的急性肝損傷均起到明顯的保護(hù)作用[1，8-9]，但也未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)研究的報(bào)道。

因此，本研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討幽門結(jié)扎性肝損傷病因機(jī)制及連翹-4保肝作用物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

ICUBIO生化分析儀(深圳生物科技有限公司)；TB110顯微鏡(日本Nikon)；BCD 216ZDJ冰箱(青島海爾有限公司)；3110 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國，Thermo Scientific)；SW-CJ-2F雙人超凈工作臺(tái)(蘇州智凈有限公司)；HH S26S恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥

連翹-4組方藥(購自內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，批號(hào)：20181164)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)：18090505)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Solarbio公司，批號(hào)：20181130)；胰蛋白酶(Solarbio公司，批號(hào)：20190926)；雙抗(Solarbio公司，批號(hào)：20181225)；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio公司，批號(hào)：710N035)；1XPBS緩沖液(Solarbio公司，批號(hào)：20201117)；硫酸銅(天津市德恩化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20191120)；75%乙醇或95%乙醇(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20180428)；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)(庫貝爾公司，批號(hào)：201003)；天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶(AST)(庫貝爾公司，批號(hào)：201001)。

1.3 細(xì)胞及動(dòng)物

LO2細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞)，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代后-80 ℃保存。

SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自遼寧長盛生物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼寧)2018-0001。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院凈化動(dòng)物室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試藥準(zhǔn)備

2.1.1 培養(yǎng)液制備 RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清。

2.1.2 凍存液制備 胎牛血清∶DMOS=9∶1的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.3 含藥血清制備 SD大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組(幽門結(jié)扎)、給藥組(連翹-4，3.9 g/kg)各組20只，灌胃給藥，空白組與模型組灌服0.5%CMC-Na溶液，給藥標(biāo)準(zhǔn)均為2 mL/100 g，每日1次，連續(xù)15 d，末次給藥后全部大鼠禁食不禁水24 h，模型組及給藥組大鼠進(jìn)行麻醉，在無菌情況下開腹幽門結(jié)扎，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，禁食禁水18 h，麻醉，采腹主動(dòng)脈血，3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取清液層，56 ℃滅活30 min，微孔濾膜(0.22 μm)過濾除菌(超凈工作臺(tái)中進(jìn)行)，室溫冷卻，于-80 ℃的低溫冰箱中保存。

2.2 LO2細(xì)胞

2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇 首先將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需用品消毒表面后放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外線照射30 min殺菌，再將低溫保存的LO2細(xì)胞取出，在37 ℃水浴中融化(最好不超過1 min)，加入10 mL培養(yǎng)基混勻，將離心機(jī)調(diào)至1 000 r/min，離心5 min，吸掉上清，加1～2 mL完全培養(yǎng)基，吹勻，再移入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱(5%CO2、37 ℃)。每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，以培養(yǎng)基顏色和細(xì)胞狀態(tài)決定是否要換液。

2.2.2 細(xì)胞傳代 待細(xì)胞生長融合達(dá)80%時(shí)，吸掉舊培養(yǎng)液，滅菌PBS洗1～2次，加1 mL胰酶消化，37 ℃靜置1～2 min，鏡下觀察LO2肝細(xì)胞的消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓收縮且大量脫落時(shí)，終止消化，1 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，吸掉上清液，加完全培養(yǎng)基吹勻，再分2瓶，放入5%的CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)。

2.2.3 細(xì)胞凍存 棄舊完全培養(yǎng)基，洗滌和消化LO2肝細(xì)胞，再終止其消化，離心去清液層，加入凍存液重懸，計(jì)數(shù)(最終密度調(diào)整至 5×106/mL～1×107/mL)，分裝。分裝后在凍存管上標(biāo)明日期、細(xì)胞名稱及保種人等，再置4 ℃→30 min；再置-20 ℃→2 h；最后放置于-80 ℃冰箱。

細(xì)胞計(jì)數(shù)：消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。蓋片覆蓋至計(jì)數(shù)板，細(xì)胞懸液吸取10 μL，打入蓋片下，鋪滿計(jì)數(shù)板與蓋片間，靜置1 min，計(jì)算4大格細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)(數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右)，計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)(mL)=4大格細(xì)胞總數(shù)/4×104[10]。

2.3 各組血清對(duì)LO2肝細(xì)胞的影響

取處于指數(shù)生長期的LO2肝細(xì)胞，進(jìn)行洗滌和消化，加入適量完全培養(yǎng)基(調(diào)整最終濃度為5×104/mL)，再將細(xì)胞懸液接種于96孔板，200 μL/孔，預(yù)培養(yǎng)24 h，吸掉舊液。分為空白組(A組)，模型組(門靜脈血清B組)，正常大鼠門靜脈血清組(C組)，含藥血清組(連翹-4腹主動(dòng)脈含藥血清D組)血清濃度均為20%，每孔200 μL，培養(yǎng)12 h(條件為5%CO2，37 ℃)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

用倒置相差顯微鏡觀察LO2肝細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組血清對(duì)LO2細(xì)胞的影響：與空白組比較，正常大鼠門靜脈血清組對(duì)LO2細(xì)胞上清液AST、ALT的水平具有明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常大鼠門靜脈血清組比較，模型對(duì)照門靜脈血清組對(duì)LO2細(xì)胞上清液AST、ALT的水平具有極顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在顯微鏡下觀察LO2肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，正常組細(xì)胞狀態(tài)良好，大小均勻，邊界清晰；模型對(duì)照門靜脈血清組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞明顯融合。模型對(duì)照門靜脈血清組與連翹-4腹主動(dòng)脈含藥血清組比較，細(xì)胞上清液AST、ALT和鏡下觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯變化。見表1和圖1。

表1 各組血清對(duì)LO2細(xì)胞肝功能指標(biāo)的影響

注：A空白組；B模型組(門靜脈血清)；C正常大鼠門靜脈血清組；D連翹-4腹主動(dòng)脈含藥血清組。

4 討論

與空白組比較，模型組門靜脈血清對(duì)LO2細(xì)胞上清液AST、ALT的水平提高顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，大小均勻，邊界清楚；模型組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞明顯融合。與模型組門靜脈血清比較，連翹-4含藥血清組細(xì)胞上清液AST、ALT的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)無明顯變化。此結(jié)果吻合與蒙醫(yī)基礎(chǔ)理論——“精華與糟粕分解”。本研究中大鼠胃幽門結(jié)扎后胃內(nèi)引起胃酸過多而導(dǎo)致“胃潰瘍”，進(jìn)一步誘發(fā)“肝功能異常”，甚至引起十二指腸潰瘍。在此過程中，幽門結(jié)扎時(shí)胃內(nèi)“消化三能”平衡被破壞(胃酸過多，即消化希拉過多)，導(dǎo)致“精華與糟粕分解”紊亂，進(jìn)入肝臟的食物精華之精華質(zhì)量受到影響而導(dǎo)致肝損傷。

綜上，通過本次研究，初步判斷幽門結(jié)扎致肝損傷的病理過程有可能來源于肝臟門靜脈。但由于實(shí)驗(yàn)方法與測量誤差等原因，從連翹-4腹主動(dòng)脈血清內(nèi)未發(fā)現(xiàn)保肝作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，因此對(duì)該方藥保護(hù)幽門結(jié)扎性肝損傷的有效物質(zhì)基礎(chǔ)方面還需進(jìn)一步探索。