基于UHPLC-HRMS探討水楊梅根水提物對(duì)大鼠血漿代謝物的影響

陳欣欣，黃彩瑩，仇雯霞，謝雪焜，李定樺，陳 闖*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

茜草科植物水楊梅(AdinarubellaHance)是我國(guó)一種傳統(tǒng)民間用藥，又稱水楊柳、水泡木、小葉水團(tuán)花、串魚木等，主要分布于江蘇、浙江、福建、廣東和廣西等地。水楊梅的根和地上部位均可作為藥用部位，其味苦、辛，性涼，具有清熱解表、活血解毒的功效，主要用于濕熱泄瀉、瘡癤腫毒等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，水楊梅根提取物能抑制人肝癌Bel7402細(xì)胞[2]、人直腸癌LS174T細(xì)胞[3]、小鼠L651白血病細(xì)胞和子宮頸癌細(xì)胞[4]的增殖。此外，研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，水楊梅的各萃取部位(石油醚、醋酸乙酯和正丁醇)，以及水楊梅石油醚萃取部位分離得到的甾體化合物，對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、銅綠假單胞桿菌和枯草芽胞桿菌有一定的抑菌活性，且對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭陰性菌[5]。而目前研究多關(guān)注水楊梅根的化學(xué)成分[6-8]和體外生物活性，對(duì)體內(nèi)代謝組學(xué)研究較少。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)以LC對(duì)化合物進(jìn)行分離、MS進(jìn)行定性分析，是一種簡(jiǎn)單、靈敏、快速的分析方法，已被廣泛應(yīng)用于血清藥物化學(xué)分析和體內(nèi)代謝研究等領(lǐng)域[9-13]。本研究基于UHPLC-Q-Exactive 軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，從血漿代謝組學(xué)角度探討水楊梅根水提物對(duì)大鼠體內(nèi)血漿代謝物的影響，為水楊梅根的藥效物質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 水楊梅根藥材購(gòu)于廣西仙茱中藥科技有限公司，經(jīng)廣西仙茱中藥科技有限公司黎秀按《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(第一冊(cè))》(2004年版)[14]鑒定為茜草科植物細(xì)葉水團(tuán)花AdinarubellaHance 的干燥根，產(chǎn)地為廣東。質(zhì)譜級(jí)甲醇(Methanol)、乙腈(Acetonitrile)、甲酸(Formic acid)均為CNW Technologies 公司產(chǎn)品。L-2-氯苯丙氨酸(2-Chloro-L-phenylalanine)純度≥98%，購(gòu)自上海恒柏生物科技有限公司。分析用水為Merck Millipore 純水，其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 1290 UHPL型超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Q Exactive Focus 型高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 2.1×100 mm型色譜柱(美國(guó)Waters公司)；Heraeus Fresco17 型離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；BSA124S-CW型天平(德國(guó)Sartorius)；JXFSTPRP-24 型研磨儀(上海凈信科技有限公司)；YM-080S 型超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)；熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.1.3 動(dòng)物 Sprague Dawley (SD)大鼠18只，體質(zhì)量(150±10) g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)(廣西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002，使用許可證號(hào)：SCXK桂2014-0003。大鼠飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房(普通級(jí))：12 h晝夜循環(huán)，具有空調(diào)設(shè)備，室溫恒定在26 ℃，濕度55%～65%，自由飲食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 方法

1.2.1 水楊梅根干膏制備 取5 000 g水楊梅根藥材(飲片)，分兩次煎煮。第1次加10倍量的水，先浸泡0.5 h，加熱煎煮1.5 h，第2次加水8倍量，煎煮1 h，煎液過(guò)濾，合并兩次提取液，濾液濃縮成稠膏后置于鼓風(fēng)干燥箱(75 ℃)72 h，即得到干浸膏約409.5 g，出膏率為8.19%，置于玻璃干燥皿中備用。

1.2.2 給藥與樣品采集 SD大鼠隨機(jī)分為空白組、水楊梅根水提物給藥組，每組9只，兩組大鼠給藥前禁食12 h(可自由飲水)?！吨腥A本草》[15]記載水楊梅根的人體最大用量為每天30 g，根據(jù)大鼠與人的體表面積換算率(6.3)及水楊梅根出膏率(8.19%)，計(jì)算大鼠日劑量為15.48 g/kg(干膏量)。將“1.2.1”所制的干膏溶解于純水中，配成1.548 g/mL水楊梅根水提物溶液灌胃給予大鼠，1次/d，連續(xù)給藥3 d，空白組灌服純水。末次給藥2 h后異氟醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血置于5 mL含肝素鈉采血管中，3 000 rpm室溫離心10 min，取上清，0.5 mL/管分裝至1.5 mL離心管中，-80 ℃凍存，備用。

1.2.3 生物樣本處理 取400 μL血清樣本，加入40 μL鹽酸(2 mol/L)；4 ℃ 渦旋1 min后靜置15 min；重復(fù)渦旋靜置4次后，加入1.6 mL乙腈沉淀蛋白；渦旋5 min，12 000 rpm[離心力13 800(×g)，半徑8.6 cm]離心5 min，取上清1 800 μL氮吹干燥；加入150 μL 80%甲醇(內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸濃度為10 μg/mL)復(fù)溶，渦旋5 min，12 000 rpm[離心力13 800(×g)，半徑8.6 cm]離心5 min；取上清至進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 上機(jī)檢測(cè)條件 色譜條件：色譜柱UPLC BEH C18(1.7 μm；2.1 mm×100 mm)；柱溫為55 ℃；流動(dòng)相：A為水(含0.1%甲酸)；B為乙腈(含0.1%甲酸)；梯度洗脫條件：0～11 min，85～25%A；11～12 min，25～2%A；12～14 min，2～2%A；14～14.1 min，2～85%A；14.1～15 min，85～85%A；15～16 min，85～85%A；流速 500 μL/min；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：利用軟件(Xcalibur，Thermo Fisher Scientific)控制Q Exactive Focus 質(zhì)譜儀，基于FullScan-ddMS2功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)如下：鞘氣流速：45 arb，輔助氣流速：15 arb，毛細(xì)管溫度：400 ℃，分辨率(full scan)：70 000，分辨率(MS/MS scans)：17 500，碰撞能量：NCE 模式下的15/30/45，噴霧電壓：4.0 kV(正離子模式)或-3.6 kV(負(fù)離子模式)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將獲得的正負(fù)離子模式下的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入XCMS軟件進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等工作。數(shù)據(jù)預(yù)處理方式如下[16]：基于相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，即變異系數(shù)Coefficient of variation，CV)對(duì)偏離值進(jìn)行過(guò)濾，只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)，然后對(duì)原始數(shù)據(jù)中的缺失值進(jìn)行模擬(Missing value recoding)，數(shù)值模擬方法為最小值二分之一進(jìn)行填補(bǔ)。利用上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法對(duì)含有MSMS數(shù)據(jù)的峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。使用SIMCA軟件(V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)(LOG)轉(zhuǎn)換及CTR(Center scaling)格式化處理，然后進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的PCA分析。將數(shù)據(jù)進(jìn)行UV (Unit variance scaling)格式化處理，對(duì)第一主成分進(jìn)行OPLS-DA建模分析，模型的質(zhì)量用7折交叉驗(yàn)證(7-fold cross validation)進(jìn)行檢驗(yàn)；然后用交叉驗(yàn)證后得到的R2Y(模型對(duì)分類變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預(yù)測(cè)性)對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判；最后通過(guò)置換檢驗(yàn)(Permutation test)，隨機(jī)多次改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機(jī)Q值，對(duì)模型有效性做進(jìn)一步檢驗(yàn)。采用以下條件進(jìn)行差異代謝物篩選：學(xué)生t檢驗(yàn)(Student’st-test)的P值(P-value)<0.05，同時(shí)OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(Variable importance in the projection，VIP)>1。使用omicshare.com/tools(https：//www.omicshare.com/tools/)在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)將正負(fù)離子模式下的差異代謝物可視化。利用MetaboAnalyst 5.0(https：//www.metaboanalyst.ca/)在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲取差異代謝物的KEGG ID號(hào)并進(jìn)行差異代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 基于 UHPLC-Q-Exactive MS的大鼠血漿代謝組學(xué)質(zhì)量控制

從18個(gè)樣本中各取等量血漿充分混合后得到質(zhì)控(Quality control，QC)樣本。使用該QC樣品進(jìn)行過(guò)程質(zhì)控和數(shù)據(jù)質(zhì)控。在正負(fù)離子模式下，QC樣品總離子流色譜圖(Total ion chromatorgraphy，TIC)色譜峰保留時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度均重疊較好(見圖1)。在正離子模式下，內(nèi)標(biāo)響應(yīng)穩(wěn)定性的RSD為8.36%，在負(fù)離子模式下，內(nèi)標(biāo)響應(yīng)穩(wěn)定性的RSD為3.45%(見表1)，均小于20%。上述結(jié)果說(shuō)明樣品處理方法和檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定性均滿足代謝組學(xué)研究要求，本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

注：A.所有QC樣品正離子TIC；B.所有QC樣品負(fù)離子TIC。

表1 QC樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)穩(wěn)定性

2.2 數(shù)據(jù)處理

正離子模式的原始數(shù)據(jù)包含33 291個(gè)Peak，經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)處理后，19 064個(gè)Peak被保留。同理，負(fù)離子模式的原始數(shù)據(jù)包含26 444個(gè)Peak，經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)處理后13 338個(gè)Peak被保留。利用上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有代謝物進(jìn)行物質(zhì)信息搜索整理，正離子模式下鑒定出187個(gè)化合物，負(fù)離子模式下鑒定出116個(gè)化合物。正負(fù)離子模式下，空白組和給藥組數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)無(wú)監(jiān)督的PCA分析結(jié)果顯示(見圖2)，兩組血漿樣本代謝輪廓可呈現(xiàn)出分離趨勢(shì)。后續(xù)的OPLS-DA分析顯示(見圖3)，兩組樣本區(qū)分非常顯著。且所建立的OPLS-DA模型在正離子模式下R2Y=0.986，Q2=0.628；在負(fù)離子模式下R2Y=0.992，Q2=0.677，均表明其穩(wěn)健可靠。隨后進(jìn)行的200輪置換檢驗(yàn)顯示(見圖3)，原模型R2Y非常接近1，說(shuō)明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況；原模型Q2比較接近1，說(shuō)明如果有新樣本加入模型，可得到比較近似的分布情況，總體看，原模型可較好解釋兩組樣本之間的差異。置換檢驗(yàn)隨機(jī)模型的Q2值均<原模型的Q2值；Q2的回歸線與縱軸的截距<0；且隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機(jī)模型的Q2逐漸下降，說(shuō)明原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。

注：A.正離子模式 PCA 分析；B.負(fù)離子模式 PCA 分析。

2.3 生物標(biāo)志物的篩選和代謝通路分析

通過(guò)篩選OPLS-DA模型中VIP>1且學(xué)生t檢驗(yàn)P<0.05的變量，正離子模式下，篩選出29個(gè)差異代謝物(見圖4A)，其中10-acetyloxy-8，8-dimethyl-2-oxo-9，10-dihydropyrano[2，3-f]chromen-9-yl) (Z)-2-methylbut-2-enoate(白花前胡素A)等17個(gè)代謝物上調(diào)，Totarol(桃柁酚)等12個(gè)代謝物下調(diào)；負(fù)離子模式下篩選出17個(gè)差異代謝物，其中5-Ethoxy-10-gingerol(5-乙氧基-10-姜酚)等10個(gè)化合物上調(diào)，16-Hydroxyhexadecanoic acid等7個(gè)化合物下調(diào)(見圖4B)。將正負(fù)離子模式下的差異代謝物合并為一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，其中16個(gè)化合物被KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)收錄(見表2 )。使用MetaboAnalyst 5.0在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路富集分析和拓?fù)浞治?，篩選潛在的靶標(biāo)通路(Pathway impact≥0.10)[17]。結(jié)果見圖5，橫坐標(biāo)Pathway impact的值越大，代謝通路越重要；縱坐標(biāo)-log10(P)的值越大，代謝通路富集分析的顯著性越好。代謝通路分析顯示，水楊梅根可影響到脂肪酸生物合成、色氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成和花生四烯酸代謝4條通路。

注：A.正離子模式 OPLS-DA 分析；B.負(fù)離子模式 OPLS-DA 分析；C.正離子模式下 200 輪置換檢驗(yàn)結(jié)果；D.負(fù)離子模式下200 輪置換檢驗(yàn)結(jié)果。

注：A.正離子模式下的差異代謝物熱圖；B.負(fù)離子模式下的差異代謝物熱圖；不同位置的色塊代表對(duì)應(yīng)位置代謝物的相對(duì)表達(dá)量。

表2 差異代謝物中被KEGG收錄的化合物

注：1.Fatty acid biosynthesis(脂肪酸生物合成)；2.Tryptophan metabolism(色氨酸代謝)；3.Biosynthesis of unsaturated fatty acids(不飽和脂肪酸的生物合成)；4.Arachidonic acid metabolism(花生四烯酸代謝)。

3 討論

單味中藥是中醫(yī)藥防治疾病的基礎(chǔ)，對(duì)單味中藥的研究不僅關(guān)乎臨床療效，也為中藥的合理應(yīng)用提供依據(jù)。本研究基于UHPLC-Q-Exactive MS技術(shù)，對(duì)水楊梅根進(jìn)行了非靶向血漿代謝組學(xué)分析。在正負(fù)離子模式下，給藥組大鼠血漿對(duì)比空白對(duì)照組大鼠血漿共篩選鑒定出45種差異代謝物，花生四烯酸代謝通路影響值為0.333，其余3條通路的通路影響值為0。因此，筆者認(rèn)為水楊梅根可通過(guò)影響花生四烯酸代謝而發(fā)揮作用。

水楊梅根治療瘡癤腫毒是其重要的臨床應(yīng)用之一。本研究發(fā)現(xiàn)，水楊梅根可下調(diào)血漿中的花生四烯酸水平?；ㄉ南┧?AA)是二十碳不飽和脂肪酸，當(dāng)細(xì)胞受刺激后，細(xì)胞膜的磷脂酶(PLA)被激活，進(jìn)而裂解膜磷脂，游離出花生四烯酸，后者通過(guò)環(huán)加氧酶和脂質(zhì)加氧酶作用生成前列腺素(PG)、血栓素 A2(TXA2)和白三烯(LT)等炎性介質(zhì)，從而導(dǎo)致局部和全身的炎癥反應(yīng)發(fā)生[18]。因此，筆者認(rèn)為水楊梅根下調(diào)血漿中的花生四烯酸水平與其抗炎作用相關(guān)，這為今后通過(guò)干預(yù)大鼠瘡瘍模型，探討水楊梅根是否能回調(diào)模型動(dòng)物的炎癥相關(guān)代謝物水平提供了參考依據(jù)。

臨床上，水楊梅根常配伍藤梨根及虎杖根辨證治療消化道惡性腫瘤，療效確切[6，19]。張蓓等[20]用水楊梅總黃酮對(duì)S180荷瘤小鼠進(jìn)行灌胃，證實(shí)了水楊梅總黃酮可提高其免疫功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)，且安全性好。葉勇等[3]用不同濃度的水楊梅根提取物處理人直腸癌LS174T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，藥物抗癌作用表現(xiàn)為劑量依賴性，且乙酸乙酯提取部位是最主要的活性部位。此外，王成功等[2]發(fā)現(xiàn)水楊梅根乙酸乙酯提取物可體外抑制人肝癌Bel7402細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與p53基因表達(dá)上調(diào)、survivin表達(dá)下調(diào)而促進(jìn)Bel7402細(xì)胞凋亡有關(guān)。研究證明，生理性血小板受體和血小板激動(dòng)劑在癌癥轉(zhuǎn)移及血管生成中起重要作用。血小板提供促凝表面，促進(jìn)惡性腫瘤相關(guān)凝血功能，且可被募集以覆蓋腫瘤細(xì)胞，從而保護(hù)它們免受免疫反應(yīng)的影響，并促進(jìn)癌癥的生長(zhǎng)和傳播[21]，表明抗血小板聚集可能是腫瘤治療的新策略。方晴霞等[22]發(fā)現(xiàn)水楊梅根黃酮類成分(ARF)能抑制5＇-二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子(PAF)及AA所誘導(dǎo)的血小板聚集，且隨ARF劑量的增加，對(duì)血小板的聚集抑制率顯著上調(diào)。TXA2可降低血小板內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度，對(duì)血小板的聚集有正反饋促進(jìn)作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)水楊梅根能降低血漿中AA水平，提示其可能通過(guò)影響TXA2，從而抑制血小板聚集發(fā)揮抗癌作用。

本研究初步闡明了水楊梅根對(duì)大鼠血漿代謝物的影響，從代謝組學(xué)角度為草藥水楊梅根的藥效物質(zhì)研究提供了一定依據(jù)。但筆者發(fā)現(xiàn)鑒定出的化合物部分未被KEGG注釋，因而基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)代謝通路分析所得到的信息有限，這導(dǎo)致一些潛在且有價(jià)值的差異代謝物作用機(jī)制未被闡明，今后還需結(jié)合其他藥理學(xué)方法進(jìn)行機(jī)制探索。