鐵皮石斛瓶苗的增殖生根和瓶內開花初探

范華雨，李慧敏，朱旭東，王鵬凱，韋慶華

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇蘇州 215008）

鐵皮石斛又叫黑節(jié)草、鐵皮斗，是蘭科草本植物。莖直立，圓柱形，屬補益藥中的補陰藥，具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺益腎、明目強腰、降血糖、增強機體免疫力等功效[1-2]。鐵皮石斛常見的繁殖方法主要有離體快繁和分株扦插。離體快繁是利用石斛生長點組織，消毒之后將其接入提供生長繁殖所需的培養(yǎng)基里，放入特定的溫光環(huán)境，進行無菌培養(yǎng)的過程，實現(xiàn)植物組織快速繁殖，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，增加經(jīng)濟收益[3-4]。近年來，關于鐵皮石斛組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究頗多，用于外植體的有種子、無菌苗幼苗莖段、原球莖及人工種子等[5-6]。而增殖分化與培養(yǎng)基的選擇有不同的結論，需要作進一步驗證。

鐵皮石斛組培苗可在培養(yǎng)容器內開花。植物的瓶內開花受許多因素控制，如植物激素含量、外植體大小和培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)的溫度、光照、培養(yǎng)基的pH 值和糖含量等[7]。探究鐵皮石斛瓶內開花，一可用作組培微景觀材料，二可提供研究所需的種子資源材料，三可用來進行雜交選育新品種，四可探究影響瓶苗開花的原因，提高快繁商品苗的生產(chǎn)效率。李茹等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加適量的外源腐胺和精胺，可提高開花率，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的多效唑后，鐵皮石斛組培苗開花率均顯著提高。李茹等[7]發(fā)現(xiàn)，以LED 光質中的紅+藍+綠光復合照射鐵皮石斛組培苗，有利于其在瓶內開花，且花期早，開花率高。王兆春等[10]發(fā)現(xiàn)低溫刺激和干旱脅迫可誘導石斛組培苗開花。可見，要想提高瓶內開花數(shù)還需要從多方面考慮。

為此，本研究設置不同培養(yǎng)基的配方，采取單因素試驗分析方法，研究不同培養(yǎng)基配方對鐵皮石斛瓶苗增殖生根和瓶內開花進程的影響，以期尋找適宜鐵皮石斛瓶苗快速生長和瓶內開花的最佳配方。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗設在江蘇省蘇州市蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院相城科技園綜合示范基地組培實驗室進行，鐵皮石斛瓶苗來源于本組培室自有保存種質。

1.2 試驗方法

1.2.1 增殖培養(yǎng)。挑選無菌、長勢一致的鐵皮石斛瓶苗待用。進入實驗室前先進行初步消毒，經(jīng)過風淋室再次進行全身消毒。然后進入無菌操作實驗室，換上無菌工作服，進行實驗操作。首先，用配置好的新潔爾滅溶液進行手部消毒，然后用鑷子夾取酒精棉，擦拭超凈工作臺進一步消毒。鐵皮石斛為叢生苗，為了更好觀察統(tǒng)計瓶苗增殖生根生長狀態(tài)，接種時把叢生的鐵皮石斛苗分切成單株苗。將初代形成的叢生芽分別轉接到不同的繼代培養(yǎng)基（表1）內進行進一步培養(yǎng)，每瓶接4 株苗，進行增殖培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種30 瓶。增殖系數(shù)（%）=增殖完成后植株數(shù)/接種植株總數(shù)。

1.2.2 生根培養(yǎng)。將繼代培養(yǎng)好的芽切出，分別轉接到不同的生根培養(yǎng)基內（表1），進行生根培養(yǎng)，計算生根率。生根率（%）=（生根苗數(shù)/接種總數(shù)）×100。

1.2.3 開花培養(yǎng)。在前期研究的基礎上，探究不同激素含量的培養(yǎng)基對鐵皮石斛增殖生根和后續(xù)開花的影響。統(tǒng)計了6 種不同的增殖和生根培養(yǎng)基接種后的開花進程（表1），進行鐵皮石斛瓶內開花的探究。30d 統(tǒng)計一次生長開花情況，60d 后測定開花指標。主要測定開花株數(shù)、花期，計算開花率，開花率（%）=開花株數(shù)（株）/接種有效株數(shù)（株）×100。

表1 組織培養(yǎng)研究使用培養(yǎng)基配方

保持溫度在24～26℃，濕度在55%～60%，光強設置為30μmol/m2·s，光周期為12h/d，培養(yǎng)周期為60d。

1.3 統(tǒng)計分析

采用office2019 進行數(shù)據(jù)處理和分析，其中顯著性差異采用SPSS16.0 系統(tǒng)中的Duncan 法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛增殖的影響

由表2 可知，P6培養(yǎng)的瓶苗增殖率最高，其次為P5，再者為P1；三者均顯著高于其他3 個，分別較P3高43.64%、25.00%和12.94%，分別較P2高50.57%、31.03%和18.39%，分別較P4高65.82%、44.30%和30.37%?？梢钥闯?，在保持6-BA 和ABA 的含量相同的情況下，改變NAA 的含量，NAA 含量越低增殖系數(shù)越高；在保持6-BA 和NAA 的含量相同的情況下，改變ABA 的含量，ABA 含量越高增殖系數(shù)越高?？梢姡珺A 1.0+NAA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L 為鐵皮石斛最佳增殖培養(yǎng)基配方。

表2 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛增殖的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛生根的影響

由表3 可知，P10下瓶苗的生根率最高，其次為P9；二者顯著高于其他2 個，分別較P8高51.78%和43.01%，分別較P7高57.01%和47.94%，但是二者之間無顯著差別?？梢?，P10為鐵皮石斛最佳生根率配方。

表3 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛生根的影響

2.3 不同培養(yǎng)基配方對瓶內開花的影響

由表4 可知，P1下鐵皮石斛的開花株數(shù)在接種30d 和60d 都是最高，其次為P10，二者顯著高于其他處理。從接種30d 和60d 后，看到在接種前期開花進程較慢，隨著培養(yǎng)時間的增加，開花數(shù)目增加較快。可見，P1顯著促進了鐵皮石斛的開花進程。

表4 不同培養(yǎng)基接種后的開花進程

圖1 不同培養(yǎng)時間下鐵皮石斛開花情況

由表5 可知，P1下鐵皮石斛的每株開花數(shù)最高，顯著高于其他處理，其次為P10，P9下最低；花期也是在P1下最大，顯著高于其他處理，其次為P10，P5下最?。婚_花率在P1下達到最高，其次為P10，二者顯著高于其他處理，P8下最小?？梢姡琍1為鐵皮石斛最佳開花培養(yǎng)基配方。

表5 不同培養(yǎng)基對開花的影響

3 結論與討論

本研究設置不同的激素配比，探究不同培養(yǎng)基配方對鐵皮石斛瓶苗的增殖生根和瓶內開花的影響。結果表明：較適合鐵皮石斛瓶苗的增殖培養(yǎng)基配方為6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L，適合的生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L，適合瓶苗瓶內開花的培養(yǎng)基配方為6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ABA 1.0mg/L。研究也發(fā)現(xiàn)，1/2MS 的培養(yǎng)基以及添加了IBA 的培養(yǎng)基容易導致瓶苗產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象，苗體普遍發(fā)黃，但能夠促使瓶苗生根。

通過對比發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛大部分開花在接種2 個月后，可能此時培養(yǎng)基中的成分大部分被消耗，瓶苗可能出于自我保護進行開花。因此，可以判斷營養(yǎng)元素的含量是導致鐵皮石斛開花的原因之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，用于增殖的6-B 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L 培養(yǎng)基，鐵皮石斛瓶苗也會開花，但開花周期至少得2 個月及以上，且花芽分化速度比較慢。此外，根據(jù)上述結果可以初步看出，第1 個月增殖效果好的培養(yǎng)基，開花效果不太明顯，而開花效果暫時明顯的，增殖效果不明顯。鐵皮石斛開花趨勢呈曲線，以1 個月為分界，第1 個月呈現(xiàn)緩慢上升，到第2 個月呈現(xiàn)急速上升趨勢；2 個月之后，開花趨勢會隨瓶內培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分消耗而下降，但其開花植株普遍較矮小，未開花植株比開花的植株要更高大、壯碩一些。可能是植物的開花消耗了植株體內的一些營養(yǎng)物質，所以開花的植株長勢較為矮小，而未開花的植株長勢更為健壯。研究結果為以后的實際生產(chǎn)提供了可靠的科學依據(jù)與技術參考。