氮素水平對(duì)土壤甲烷氧化和硝化微生物相互作用的影響*

潘 紅，李 勇，孟春梅，鄭 燕，劉杏梅，諸葛玉平，賈仲君，邸洪杰，徐建明

（1. 浙江省農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，杭州 310058；2. 土肥高效利用國(guó)家工程研究中心，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東泰安 271018；3. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002；4. 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008）

甲烷（CH）和氧化亞氮（NO）是兩種重要的溫室氣體，其全球增溫潛勢(shì)分別是二氧化碳（CO）的28 倍～34 倍和265 倍～298 倍。旱地土壤（森林土壤、草原土壤等）是大氣甲烷的有效匯，因其具有能夠氧化大氣濃度甲烷的高親和力甲烷氧化單加氧酶（MMO）。好氧土壤中，NO 的主要產(chǎn)生途徑是有氧硝化作用。氨氧化過(guò)程是有氧硝化的第一步，也是限速步驟，主要由具有氨單加氧酶（AMO）的氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）完成。研究發(fā)現(xiàn)，MMO 在進(jìn)化上和AMO 密切相關(guān)，它們有高度相似的氨基酸序列、相似的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)、相似結(jié)構(gòu)的底物（CH和NH）、相似的被抑制特性和相似的生態(tài)位，而且都競(jìng)爭(zhēng)N 源。甲烷氧化細(xì)菌（MOB）的生長(zhǎng)繁殖需要氮源，但其自身不具備固氮能力，因此，MOB 需要獲取外源氮源。鑒于以上研究背景，甲烷氧化和硝化過(guò)程有著必然的內(nèi)在聯(lián)系。

草原生態(tài)系統(tǒng)是世界上最大的陸地生態(tài)系統(tǒng)，草地面積占我國(guó)國(guó)土面積的41%。草原土壤既是CH的匯，又是NO 的源，因此，有關(guān)草原生態(tài)系統(tǒng)中土壤的碳氮循環(huán)一直是研究熱點(diǎn)問(wèn)題。當(dāng)前關(guān)于草原土壤系統(tǒng)中硝化過(guò)程和甲烷氧化過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，AOB 和MOB 分布廣泛，在多種草原土壤生境中參與硝化和甲烷氧化過(guò)程。旱地土壤類(lèi)群（USC）MOB 因其具有高甲烷親和力在草原土壤中的重要性逐漸被發(fā)現(xiàn)。但目前關(guān)于草原土壤中不同氮水平下甲烷氧化活性和相關(guān)活性微生物，以及甲烷氧化和硝化之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系機(jī)制的研究較少。因此本研究選取內(nèi)蒙古錫林郭勒盟草原土壤為研究對(duì)象，結(jié)合穩(wěn)定同位素核酸探針（DNA-SIP）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Miseq 測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)，分析不同氮水平下，甲烷氧化和硝化微生物的相互關(guān)系，闡明草原生態(tài)系統(tǒng)CH氧化和硝化的交互作用機(jī)制，以期為深入了解草原土壤碳氮循環(huán)、提高草原氮肥利用率、增強(qiáng)草原生產(chǎn)力、實(shí)現(xiàn)溫室氣體減排提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品概況

土壤樣品采自位于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟草原（43°26′—44°39′N(xiāo)，115°32′—117°12′E）的中國(guó)科學(xué)院內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)定位研究站。該地區(qū)冬季寒冷，夏季涼爽，屬于半干旱大陸性季風(fēng)氣候，每年大約102～136 d 無(wú)霜期，全年平均氣溫-0.4 ℃，年均降水量350 mm 左右，降雨多發(fā)生在六月至八月，雨熱同期，季節(jié)分布不均，與植物生長(zhǎng)期一致。主要植被類(lèi)型包括羊草（）、大針茅（） 和 粗 隱 子 草（）。土壤類(lèi)型為暗栗鈣土。該樣地1996 年以前自由放牧，自1996 年起禁牧圍封。樣地大小為400 m × 60 m，包括5 個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)70 m × 60 m，相鄰的兩個(gè)小區(qū)之間有10 m 的緩沖帶便于取樣。2016 年8 月用5 cm 直徑土鉆按照“S”型取樣法采集0～20 cm 表層土，全部混勻，研磨過(guò)2 mm 篩。土壤基本理化性質(zhì)如下：pH 7.22，容重1.32 g·cm，有 機(jī) 質(zhì) 25.47 g·kg，全 碳 16.67 g·kg，全 氮1.50 g·kg， 硝 態(tài) 氮 63.36 mg·kg， 銨 態(tài) 氮4.45 mg·kg，有效磷（Olsen P）7.31 mg·kg，速效鉀 251.10 mg·kg。

1.2 微宇宙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

將相當(dāng)于 6.0 g 干重的新鮮土壤樣品轉(zhuǎn)移至120 mL 血清瓶，調(diào)節(jié)40%田間持水量，膠塞加鋁蓋封口，25 ℃黑暗中預(yù)培養(yǎng)，每周監(jiān)測(cè)CO濃度，當(dāng)濃度降至5 000 μL·L時(shí)開(kāi)始正式培養(yǎng)。

正式培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共設(shè)7 個(gè)處理，如表1 所示，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。CH處理（99 atom%C，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA）用以分析甲烷氧化活性和活性甲烷氧化微生物；CO+Urea（99 atom%C，上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海，中國(guó)）處理用以分析硝化活性和活性硝化微生物；CH+CO+Urea 和CH+CO+Urea處理用以分析甲烷氧化和硝化之間的相互作用。其中，添加尿素的處理均包括N 20 μg·g干土（U20）和100 μg·g干土（U100）兩個(gè)氮素水平。試驗(yàn)流程如圖1 所示，每周用高純空氣（20% O，80% N）換氣1 min，保證有氧環(huán)境，同時(shí)以溶液的形式逐滴加入尿素溶液，調(diào)節(jié)60%田間持水量，血清瓶膠塞加鋁蓋密封后加5%的CO。其中甲烷濃度動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，隨時(shí)添加，保證1%濃度。在25 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)21 d，分別在0、7、14、21 d 進(jìn)行破壞性取樣。所取樣品分兩部分，2 g 左右保存在-80 ℃冰箱，用以提取土壤DNA；剩余樣品用以分析硝化活性。

表1 微宇宙培養(yǎng)試驗(yàn)處理概況Table 1 Schedule of the treatments

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig. 1 The experimental procedure

1.3 DNA 提取和SIP 分層

將0 d 和21 d 的土壤樣品用FastDNA Spin Kit for Soil（MP）提取土壤基因組總DNA。用0.7%的凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性，NanoDrop? ND-2000 UV-Vis spectrophotometer（NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA）檢測(cè)DNA 的質(zhì)量和純度。DNA 樣品-20 ℃冰箱保存，用以進(jìn)行超高速等密度梯度離心。

SIP 分層方法參考文獻(xiàn)[13]。具體操作方法如下：大約3 μg DNA 與4.9 mL 氯化銫（CsCl）溶液混合，調(diào)節(jié)浮力密度至1.725 g·mL。然后將混合液轉(zhuǎn)移至5.1 mL 超高速離心試管中，調(diào)平密封后用貝克曼Vti65.2 轉(zhuǎn)子（Beckman Coulter Inc.，Palo Alto，CA，USA）在20 ℃條件下以177 000×的速度離心44 h。離心結(jié)束后，利用NE-1000 注射器泵（New Era Pump Systems Inc.，F(xiàn)armingdale，NY，USA）將新滅菌蒸餾水以穩(wěn)定流速（0.38 mL· min）從上向下將溶于CsCl 中的DNA 置換到15 個(gè)1.5 mL 離心管中，即每個(gè)土壤DNA 樣品分層后總共得到15層DNA 組分溶液，每層體積為380 μL，取65 μL用手持式AR200 折光率儀（Reichert Inc.，Buffalo，NY，USA）測(cè)定折光率。將分層后的DNA 組分溶液用PEG6000 和乙醇純化，溶于30 μL 新滅菌蒸餾水進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 甲烷氧化菌pmoA 和氨氧化菌amoA 基因的定量PCR

將0 d 和21 d 的總DNA 以及上述分層純化后的DNA 樣品進(jìn)行和基因的定量PCR分析（LightCycler 480，Roche Applied Science），具體引物信息和PCR 條件見(jiàn)表2。反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，Dalian，China）、1.5 μL DNA 模板（1～10 ng）、0.79 μL milli-Q水，體系中引物終濃度0.5 μmol·L。最后跑溶解曲線，利用 50～99 ℃的升溫連續(xù)檢測(cè)熒光以確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。本實(shí)驗(yàn)定量PCR 擴(kuò)增效率在80.5%～108.3%之間，值在0.990～0.998 之間。

表2 本試驗(yàn)中引物信息及PCR 條件Table 2 Primers and conditions used in this study

1.5 Miseq 測(cè)序、系統(tǒng)發(fā)育分析和共線性網(wǎng)絡(luò)分析

將0 d 和21 d 的總DNA 以及上述分層純化后的重層DNA 樣品進(jìn)行Miseq 高通量測(cè)序。利用Illumina?MiSeq 測(cè)序儀（Illumina，San Diego，CA，USA）對(duì)上述DNA 的16S rRNA 基因的V4 區(qū)進(jìn)行測(cè)序，引物序列及擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。本實(shí)驗(yàn)中，只有序列長(zhǎng)度大于200 bp，平均質(zhì)量大于25，沒(méi)有模糊噪聲，至少80%符合16S rRNA 序列的結(jié)果才會(huì)進(jìn)行后續(xù)分析。在97%序列相似度水平上進(jìn)行OTU（可操作分類(lèi)單元）聚類(lèi)，最后參考Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 進(jìn)行物種注釋。

總DNA 樣品共得到1 149 320 條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣品得到47 888 個(gè)高質(zhì)量序列。其中屬于細(xì)菌的序列有1 123 384 條，占97.74%；屬于古菌的序列有25 936 條，占2.26%。重層DNA 樣品在CH、U20+CO、U100+CO、U20+CH+CO和U100+CH+CO處理下分別得到426 842、407 179、429 748、501 376 和480 393 條高質(zhì)量序列。

選取屬于MOB、AOA、AOB 和NOB 的序列，用Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA 7.0）分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。以重層MOB、AOB 和NOB 的OTU 豐度表為原始數(shù)據(jù)，采用Spearman 相關(guān)系數(shù)模型，顯著性＜ 0.05，通過(guò)CoNet 軟件構(gòu)建共線性網(wǎng)絡(luò)圖，Gephi 0.9.2 對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化分析。網(wǎng)絡(luò)圖包括節(jié)點(diǎn)和邊，各節(jié)點(diǎn)代表不同的物種，以顏色區(qū)分。邊代表物種之間的相互作用，紅色和綠色分別代表正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，線的粗細(xì)表示相關(guān)性的大小。將總DNA 和重層DNA 的測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至NCBI 的Sequence Read Archive（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索號(hào)分別為PRJNA611699 和PRJNA611713。

1.6 數(shù)據(jù)處理

硝化活性、甲烷氧化活性、/基因豐度和相對(duì)豐度的顯著性差異分析通過(guò)SPSS 20.0 單因素方差分析（one-way ANOVA）的Duncan 多重檢驗(yàn)完成；作圖通過(guò)Origin 9.0 完成；＜ 0.05 表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 甲烷氧化活性和甲基營(yíng)養(yǎng)微生物

氮素水平對(duì)甲烷氧化活性和相關(guān)微生物豐度均有顯著影響（圖2），經(jīng)過(guò)21d 的微宇宙培養(yǎng)，相比不施氮（U0），甲烷氧化活性、基因豐度和甲基營(yíng)養(yǎng)微生物相對(duì)豐度在低氮水平（U20）下顯著增加，在高氮水平（U100）下顯著降低。在U0、U20 和 U100 三個(gè)處理下，甲烷氧化活性分別是37.79、45.27 和16.11 μmol·g干土，基因豐度分別是3.08×10、4.24×10和9.50×10copies·g干土。甲烷氧化活性、基因豐度以及甲基營(yíng)養(yǎng)微生物的相對(duì)豐度均在不同氮水平下呈現(xiàn)出“低促高抑”的規(guī)律（圖2）。

圖2 甲烷氧化活性（a）、甲烷氧化細(xì)菌pmoA 基因豐度（b）和甲基營(yíng)養(yǎng)微生物相對(duì)豐度（c～d）分析Fig. 2 Changes in methane oxidation activity（a） and quantitative distribution of methylotrophs（b-d） in soil microcosms over an incubation period of 21 days

2.2 硝化活性和硝化微生物

凈硝化速率、硝化微生物豐度和相對(duì)豐度如圖3 所示。U20、U20+CH、U100 和U100+CH的凈硝化速率分別為51.57、34.60、163.50 和165.02 μg·g干土（圖3a）；AOB基因豐度分別為1.90×10、1.23×10、6.34×10、8.04×10copies·g干土（圖3b）。低氮水平下，CH的存在顯著抑制硝化活性和AOB基因豐度；而高氮水平下，CH的存在對(duì)硝化活性和AOB基因豐度沒(méi)有顯著影響。AOB 和NOB 的相對(duì)豐度也符合該規(guī)律（圖3d，3f）。AOA基因的豐度和相對(duì)豐度在培養(yǎng)21 d 之后顯著降低，甲烷存在與否對(duì)AOA基因豐度影響不顯著（圖3c，圖3e）。

圖3 凈硝化活性（a）和氨氧化微生物amoA 基因豐度（b～c），硝化微生物相對(duì)豐度（d～f）分析Fig. 3 Net nitrification activity (a) and quantitative distribution of nitrifiers (b-f) in soil microcosms over an incubation period of 21 days

2.3 DNA-SIP 技術(shù)鑒定活性甲烷氧化和硝化微生物

離心后每個(gè)樣品分為 15 層，浮力密度在1.676～1.791 g·mL之間。對(duì)每一層進(jìn)行和基因的定量PCR 分析，然后將每一層的分析結(jié)果與各層次中最大的基因豐度作比，得到和基因在各浮力密度梯度中的分布圖（圖4a）。甲烷氧化菌在不施氮處理中被顯著標(biāo)記，低氮處理增加了MOB 被標(biāo)記的程度，而高氮處理則降低了MOB 的標(biāo)記程度。AOB 在低氮和高氮水平下均被顯著標(biāo)記，尤其是在高氮水平下的標(biāo)記更顯著。低氮水平下，甲烷的存在抑制AOB 的被標(biāo)記程度。低氮和高氮水平下，AOA 均沒(méi)有被標(biāo)記。根據(jù)定量分布結(jié)果選取重層DNA（3～12 層）進(jìn)行高通量測(cè)序，選擇分別屬于MOB、AOB 和NOB 的OTU 繪制各浮力密度上的相對(duì)豐度分布圖，結(jié)果如圖4b、圖4c。MOB 和AOA 的相對(duì)豐度在各浮力密度的分布趨勢(shì)和上述定量分析的結(jié)果完全一致。AOB 和NOB 的相對(duì)豐度分布圖顯示低氮水平和高氮水平下，甲烷的存在對(duì)AOB 和NOB 的被標(biāo)記程度均有抑制效果。

圖4 甲基營(yíng)養(yǎng)微生物和硝化微生物豐度和相對(duì)豐度在不同浮力密度上的分布Fig. 4 Quantitative distribution of methanotrophs as well as nitrifiers across the entire buoyant density gradient of the fractionated DNA from soil microcosms after incubation for 21 days

2.4 活性甲烷氧化微生物和硝化微生物的群落結(jié)構(gòu)

如圖5 所示，草原土壤99.7%以上的MOB 屬于甲基桿菌屬（）；活性MOB 包括甲基桿菌屬（）和甲基暖菌屬（），以為主，占90%以上?；钚訫OB 在U0+CH、U20+CH和U100+CH的處理中所占的比例分別為92.62%、96.35%和91.79%，活性MOB 所占的比例分別為7.38%、3.65%和8.21%。硝化微生物AOB 主要包括亞硝化球菌屬（）、亞硝化螺旋菌屬（）和亞硝化單胞菌屬（），分別占72.00%、26.00%和2.00%。65%以上的活性AOB 為，其在U20、U20+CH、U100、U100+CH處理中對(duì)AOB 的占比分別為65.33%、80.23%、78.30%和82.10%；在AOB 中的占比分別為28.41%、10.13%、20.77%和16.13%；在AOB 中的占比分別為6.25%、9.64%、0.93%和1.77%。該草原土壤中的亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（NOB）均隸屬于，包括、和三個(gè)種。活性NOB 以為主，其在U20、U20+CH、U100、U100+CH處理的占比分別是：71.3%、61.9%、 78.4%和78.8%；的占比分別為：23.6%、27.7%、16.9%和 14.5%；的占比分別為5.1%、10.4%、4.7%和6.7%。

圖5 活性甲烷氧化微生物和硝化微生物的群落組成分析Fig. 5 Proportional changes of active methanotrophs and nitrifying phylotypes in SIP microcosms after an incubation period of 21 days

2.5 活性甲烷氧化微生物和硝化微生物的共線性網(wǎng)絡(luò)

為明確活性甲烷氧化微生物和硝化微生物的相互作用，將重層MOB、AOB 和NOB 的高豐度OTU構(gòu)建共線性網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MOB 與AOB 存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，此外，MOB 還與NOB 存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，AOB 與NOB 存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

圖6 活性MOB、AOB 和NOB 的共線性網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 6 Network analysis of co-occurring phylotypes of active MOB，AOB and NOB in microcosms

3 討 論

3.1 氮素水平對(duì)甲烷氧化活性和活性甲烷氧化微生物的影響

本世紀(jì)初，Stein 等提出銨鹽對(duì)MOB 刺激還是抑制取決于銨態(tài)氮與甲烷態(tài)碳的比例（N-CH）。然而，Bodelier和Zheng等發(fā)現(xiàn)N-CH比分別為200 和0.11 時(shí)，尿素添加均顯著刺激甲烷氧化。而本實(shí)驗(yàn)中U100（100 μg·g干土）處理的N-CH比僅為0.70，但是顯著抑制了甲烷氧化。同樣，Zhang等通過(guò)四年田間試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)100 kg·hm·a（約158 μg·g干土）的氮添加顯著抑制甲烷氧化。Zhao等推測(cè)氮肥對(duì)甲烷氧化的刺激或抑制作用可能取決于主要甲烷氧化菌的種系型，比如，Zheng 等發(fā)現(xiàn)水稻土中添加尿素后，活性甲烷氧化微生物以為主，而未施加尿素的處理以為主。在本草原土的試驗(yàn)中，無(wú)論是否添加尿素以及添加尿素多少，均是以為主。因此，有關(guān)氮素水平對(duì)甲烷氧化的機(jī)理尚不明確，未來(lái)關(guān)于氮素對(duì)甲烷氧化影響的研究可考慮多種類(lèi)型土壤的綜合分析。

3.2 甲烷對(duì)凈硝化活性和活性硝化微生物的影響

類(lèi)似于對(duì)MOB 的分析，本實(shí)驗(yàn)對(duì)氨氧化功能微生物在0 d 和21 d 的總DNA 分別進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示（圖3b），低濃度和高濃度氮添加均會(huì)刺激AOB 豐度的增長(zhǎng)，而抑制AOA 的繁殖，說(shuō)明AOB 在硝化作用過(guò)程中具有重要作用。DNA-SIP 結(jié)果發(fā)現(xiàn)AOB 在各處理中被C 標(biāo)記，而AOA 在各種處理中均未表現(xiàn)出明顯的被標(biāo)記跡象（圖4a），說(shuō)明AOB 同化了來(lái)自CO的C，進(jìn)一步證明AOB是驅(qū)動(dòng)該草原土壤硝化作用的活性硝化微生物。

不同浮力密度范圍的AOB分布，以及AOB 和NOB 相對(duì)豐度的分布進(jìn)一步表明低氮水平下，甲烷添加顯著抑制了活性硝化微生物同化CO（圖4a，圖4c）。Zheng 等在水稻土的研究發(fā)現(xiàn)，100 μg·g干土的尿素處理，甲烷添加顯著抑制硝化活性和活性硝化微生物。而本研究發(fā)現(xiàn)，在草原土壤中，添加20 μg·g干土的尿素，甲烷即顯著抑制活性硝化微生物同化CO，降低硝化活性，而100 μg·g干土的尿素處理下，硝化活性和活性硝化微生物對(duì)甲烷添加無(wú)響應(yīng)。無(wú)機(jī)氮對(duì)于生物量的形成是至關(guān)重要的，尤其是對(duì)于那些缺乏固定分子態(tài)N 的甲烷氧化菌來(lái)說(shuō)。說(shuō)明甲烷對(duì)硝化活性的抑制作用可能只出現(xiàn)在氨氧化底物不足時(shí)，氨氧化微生物和甲烷氧化微生物競(jìng)爭(zhēng)N 源，一部分N 作為N源被甲烷氧化菌同化，但是當(dāng)N 源濃度較高時(shí)，甲烷氧化微生物反被抑制（圖2，圖4），喪失了與氨氧化微生物競(jìng)爭(zhēng)的能力。結(jié)合上述氮水平對(duì)甲烷氧化的影響，氮素添加體現(xiàn)出對(duì)甲烷氧化的刺激效應(yīng)時(shí)，甲烷的存在就會(huì)抑制氮素轉(zhuǎn)化（硝化作用）；氮素添加體現(xiàn)出對(duì)甲烷氧化的抑制效應(yīng)時(shí)，甲烷的存在對(duì)氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程（硝化作用）沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明甲烷氧化和硝化過(guò)程的相互作用關(guān)系受氮素水平的調(diào)控。

3.3 活性甲烷氧化和硝化微生物及相互作用

群落組成分析發(fā)現(xiàn)，活性MOB 群落結(jié)構(gòu)比較單一，以Type Ia 的甲基桿菌屬（）為主，占90%以上，還有一些Type Ib 的甲基暖菌屬（）和極少比例的 Type II 型的。一方面，研究發(fā)現(xiàn)Type Ia 型甲烷氧化菌在濕地、水稻土、冰下水系等多種環(huán)境中均作為主要的甲烷氧化微生物；另一方面，通過(guò)菌株分離分析發(fā)現(xiàn)，高濃度甲烷條件下的活性遠(yuǎn)高于低濃度甲烷環(huán)境。此外，在本試驗(yàn)中，尿素施入并沒(méi)有改變草原土壤中活性甲烷氧化微生物的群落組成，這一結(jié)果與Zhao 等在水稻土中的發(fā)現(xiàn)一致，說(shuō)明草原土和水稻土中氮有效性不是決定甲烷氧化微生物組成的關(guān)鍵因子。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活性硝化微生物以AOB 和NOB 為主，這一結(jié)果與之前在草原土壤、水稻土壤和森林土壤中的研究結(jié)果一致。

尿素對(duì)甲烷氧化菌群落的低促高抑主要反應(yīng)在MOB，菌株生長(zhǎng)需要氮源，但其不具備固氮能力，因此，氮施入可促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖。但隨著施氮量增加，硝化活性增強(qiáng)，硝化作用產(chǎn)生的NHOH 和NO以及硝化產(chǎn)物NO對(duì) MOB 均存在毒害作用；活性AOB 和NOB 比例隨施氮量增加而增加，導(dǎo)致MOB 與AOB/NOB 在同一生境中競(jìng)爭(zhēng)O、NH-N 和生存空間，網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)與活性硝化微生物（AOB 和NOB）存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)合低氮條件下，甲烷氧化增強(qiáng)而硝化被抑制；高氮水平下，硝化增強(qiáng)而甲烷氧化被抑制，說(shuō)明草原土壤中甲烷氧化和硝化之間存在氮引發(fā)的MOB 與AOB/NOB 之間的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用關(guān)系。

4 結(jié) 論

草原土壤甲烷氧化活性及微生物功能活性在低濃度氮素水平下顯著增加，而在高濃度氮素水平下顯著降低，呈現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象。N 對(duì)甲烷氧化的影響（刺激或抑制）可能是土壤條件和主要微生物種系型共同作用的結(jié)果。DNA-SIP 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性甲烷氧化微生物以為主，活性硝化微生物以AOB 和NOB 為主。而網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)MOB 和AOB/NOB 之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明甲烷氧化和硝化微生物之間存在競(jìng)爭(zhēng)性相互作用。以上結(jié)果表明甲烷氧化和硝化過(guò)程的相互作用受氮素水平的調(diào)控。