一株雞傳染性貧血病毒的分離鑒定及全基因組序列分析

胡峰 朱彤 高月花 黃兵 宋敏訓(xùn) 劉丹丹 汪建華 李玉峰

摘 要：利用MDCC-MSB1細(xì)胞系從某養(yǎng)雞場(chǎng)疑似雞傳染性貧血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）感染的發(fā)病雞組織病料中進(jìn)行病毒分離，并通過(guò)PCR、病毒基因序列測(cè)序分析，確定分離到一株雞源CIAV，并命名為CZ16。將分離株全基因組進(jìn)行PCR分段擴(kuò)增、測(cè)序，結(jié)果顯示分離株CZ16基因組序列全長(zhǎng)為2 298 bp，VP1、VP2、VP3基因大小分別為1 350、651、366 bp，兩端5'和3'非編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為358 bp和117 bp。全基因組序列同源性分析結(jié)果顯示CZ16與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的36個(gè)CIAV毒株全基因組核苷酸同源性在95.6%～99. 6%之間，與國(guó)內(nèi)毒株GD-102關(guān)系最近，與澳大利亞毒株（U65414.1）關(guān)系最遠(yuǎn)。研究結(jié)果為雞傳染性貧血病病原學(xué)研究提供材料。

關(guān)鍵詞：傳染性貧血病毒;病毒分離;全基因組;進(jìn)化分析

雞傳染性貧血病是由雞傳染性貧血病毒（CIAV）感染引起的雞主要免疫抑制病，其中雛雞最易感[1]。CIAV感染后主要病理特征是胸腺萎縮和骨髓黃化，從而造成貧血和免疫抑制，容易繼發(fā)其它病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)感染[2-3]。CIAV不僅可以感染雞，還可感染野生鳥(niǎo)類(lèi)[4]。CIAV屬于圓環(huán)病毒科，環(huán)形病毒屬，病毒粒子呈球形，無(wú)囊膜。病毒基因組為單股環(huán)狀DNA，編碼3個(gè)蛋白質(zhì)（VP1、VP2、VP3）[5]。目前發(fā)現(xiàn)的CIAV均屬于同一個(gè)血清型，但不同地區(qū)不同毒株之間毒力不同，基因組序列也存在一定的差異[6]。本實(shí)驗(yàn)室接診了某養(yǎng)殖公司送檢的疑似雞傳染性貧血病毒感染病例，通過(guò)病毒分離、PCR檢測(cè)、病毒基因序列測(cè)序分析，確定分離到1株CIAV，為進(jìn)一步了解CIAV的流行規(guī)律提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

病料：來(lái)自河北某養(yǎng)雞場(chǎng)。

試劑：高保真聚合酶，GenStar產(chǎn)品;DNA提取試劑盒，AxyGen公司產(chǎn)品;克隆載體pMD18T，購(gòu)自寶生物（大連）生物技術(shù)有限公司;MDCC-MSB1細(xì)胞，哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的CIAV毒株基因序列設(shè)計(jì)并合成3對(duì)引物用于病毒分離鑒定和全長(zhǎng)基因組擴(kuò)增。

病毒鑒定引物對(duì)：CAV-F：5'-GGACCATCAA

CGGTGTTCAG-3'，CAV-R：5'-CCTCAAGTCCGG

CACATTCT-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為200 bp。

擴(kuò)增VP1和3'UTR基因引物對(duì)：3VP1-F：5'-ATGGCAAGACGAGCTCGCAGAC-3'，3VP1-R：5'-GATTGTGCGATAAAGCCATTTG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 467 bp。

擴(kuò)增VP2（含VP3）和5'UTR基因引物對(duì)：5VP2-F：5'-GCATTCCGAGTGGTTACTATTCC-3'，

5VP2-R：5'-TTACACTATACGTACCGG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 009 bp，引物由青島擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 病毒分離

無(wú)菌采集的病死雞肝臟、脾臟等臟器，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)初步確定為CIAV陽(yáng)性。病料混合后以1∶5比例加入含有青霉素、鏈霉素的滅菌生理鹽水，研磨，離心取上清，過(guò)濾除菌后接種于MDCC細(xì)胞，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收集細(xì)胞懸液，-80 ℃保存。

1.4 PCR鑒定

按照試劑盒（Axygen）說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞懸液病毒核酸，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系25 μL：2 ×Taq PCR StarMix 12.5 μL，

上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板2 μL，超純水9.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min;94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并測(cè)序。

1.5 病毒全基因組克隆

取1.4中提取的病毒核酸，利用設(shè)計(jì)的引物（3VP1-F/3VP1-R， 5VP2-F/5VP2-R）PCR擴(kuò)增病毒全基因組序列，PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，送青島擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 病毒全基因組序列分析

對(duì)全基因組序列進(jìn)行拼接，并利用Mega6.0軟件將分離株與其它在GenBank已發(fā)表的36個(gè)毒株進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

組織病料經(jīng)無(wú)菌處理后接種MDCC細(xì)胞，48 h后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，細(xì)胞死亡，碎片增多，而對(duì)照組MDCC未出現(xiàn)細(xì)胞病變（圖1）。將病毒擴(kuò)大培養(yǎng)，并將該分離株命名為CZ16。

2.2 特異性PCR檢測(cè)

以提取的第2代和第4代細(xì)胞培養(yǎng)病毒DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約200 bp處出現(xiàn)目的條帶（圖2）。

注：M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1：陰性對(duì)照;2：第2代細(xì)胞毒;3：第4代細(xì)胞毒。

2.3 全基因組分段擴(kuò)增和序列分析

病毒全基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得兩條目的片段，且大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18T載體中，測(cè)序結(jié)果顯示分離株CZ16基因組全長(zhǎng)為2 298 bp， 其中VP1基因大小為1 350 bp，VP2基因大小為651 bp，VP3基因大小為366 bp，VP3基因完全包括在VP2基因中，基因組的兩端為5'和3'非編碼區(qū)，長(zhǎng)度分別為358 bp和117 bp，與已知的CIAV基因組結(jié)構(gòu)一致，均無(wú)缺失或插入。同源性分析表明CZ16與GenBank中收錄的CIAV流行株全基因組核苷酸同源性在98.61%～99. 56%之間。CZ16 VP1氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株Cux-1有12個(gè)氨基酸差異，而與中國(guó)毒株SC-MZ只有1個(gè)氨基酸差異。氨基酸序列分析還發(fā)現(xiàn)了CZ16與其它36個(gè)毒株VP1氨基酸序列的一些變異位點(diǎn)，這些變異位點(diǎn)主要分布于VP1基因的aa 136～157、aa 357～376及aa 436～448區(qū)域（圖4）。A6AD6A04-CE0E-4BF6-8BBB-8B1CF407BF53

2.4 分離株遺傳進(jìn)化分析

分離株CZ16與其它GenBank已發(fā)表的CIAV毒株全基因組序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示， CZ16與亞洲流行毒株親源關(guān)系較近，其中與中國(guó)分離株GD-102（KU050677.1）關(guān)系最近，與澳大利亞的U65414.1關(guān)系最遠(yuǎn)（圖5）。

3 討論

雞傳染性貧血病對(duì)雞群的主要危害是產(chǎn)生免疫抑制，繼而造成雞群易感其它病毒和細(xì)菌，使得疫病發(fā)生更加復(fù)雜[7]。雞傳染性貧血病是家禽重要的垂直傳播性疫病，嚴(yán)重影響家禽養(yǎng)殖，特別是種業(yè)生產(chǎn)。目前，種業(yè)已成為國(guó)家戰(zhàn)略性和基礎(chǔ)性核心產(chǎn)業(yè)，種源質(zhì)量直接關(guān)系到家禽業(yè)健康發(fā)展的未來(lái)，對(duì)垂直傳播性疫病進(jìn)行研究是保障家禽種源質(zhì)量的核心和關(guān)鍵。由于CIAV容易與其它病毒和細(xì)菌混合感染，所以病原分離較困難。本研究基于CIAV易感細(xì)胞MDCC，成功分離獲得一株CIAV，并對(duì)分離株基因組序列進(jìn)行分析。

基因序列分析結(jié)果表明，分離株CZ16與GenBank中收錄的CIAV流行株全基因組核苷酸同源性在98.61%以上，說(shuō)明該分離株變異很小。VP1氨基酸序列分析結(jié)果表明變異位點(diǎn)散在分布于基因中，但主要還是集中在關(guān)鍵的氨基酸區(qū)域，特別是aa 136～157高變區(qū)域。VP1基因編碼CIAV的衣殼蛋白，也是病毒的主要抗原基因，它的變異可能與病毒和宿主相互作用有關(guān)，但具體變異機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。已有研究表明CIAV VP1蛋白第394位氨基酸是決定病毒致病性強(qiáng)弱的關(guān)鍵位點(diǎn)，谷氨酰胺（Q）代表強(qiáng)感染性，組氨酸（H）代表弱感染性[8]。本研究中，分離株CZ16 VP1蛋白第394位氨基酸是Q，說(shuō)明該分離株是強(qiáng)感染性毒株，但其對(duì)雞的致病性還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，所比對(duì)的37個(gè)CIAV毒株既有來(lái)自中國(guó)、韓國(guó)、日本、馬來(lái)西亞等亞洲毒株，也有美國(guó)、德國(guó)等歐美來(lái)源毒株，它們分布在各個(gè)進(jìn)化分支中，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的地域性。本研究中，分離株CZ16與國(guó)內(nèi)分離株GD-102關(guān)系最近，與澳大利亞分離株U65414.1關(guān)系最遠(yuǎn)。

本研究成功分離到一株CIAV，并對(duì)其全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，為更全面了解CIAV流行規(guī)律、致病性提供材料，同時(shí)為雞傳染性貧血病的有效防控奠定一定的基礎(chǔ)。

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Isolation and Complete Genomic Sequence Analysis of

a Chicken Infectious Anemia Virus Strain

HU Feng1， ZHU Tong1， GAO Yuehua1， HUANG Bing1， SONG Minxun1，

LIU Dandan1， WANG Jianhua2， LI Yufeng2

（1.Institute of Poultry Science， Shandong Academy of Agricultural Sciences / Shandong Provincial Key Laboratory of Immunity and Diagnosis of Poultry Diseases， Jinan ?250100，China;A6AD6A04-CE0E-4BF6-8BBB-8B1CF407BF53

2. Shandong Hekangyuan Biological Breeding Co.， Ltd， Jinan ?250000，China）

Abstract： Chicken infectious anemia virus （CIAV） strain CZ16 was successfully isolated on MDCC-MSB1 cells from chicken flock suspicious of infected CIAV， and identified by PCR and gene sequence analysis. The complete genomic sequence of the virus was amplified by PCR， cloned， and sequenced. The results showed that the whole genome of CZ16 was comprised of 2298 nt， and the length of VP1， VP2， and VP3 gene was 1350，651 and 366 bp， respectively. The length of 5' and 3' untranslated regions was 358 bp and 117 bp， respectively. The nucleotide homology of complete genomic sequences between CZ16 strain and other CIAV isolates ranged from 95.6%～99.6%. Based on phylogenetic analysis of the complete genomic nucleotide sequence of CZ16 strain and other CIAV isolates， the phylogenetic tree showed a relatively close genetic distance from the internal strain GD-102， and a far genetic distance from the external strain （U65414.1） of Australia. A CIAV stain was isolated successfully and analyzed， which provided material for further study.

Keywords： Chicken infectious anemia virus;Isolation;complete genome;Phylogenetic analysisA6AD6A04-CE0E-4BF6-8BBB-8B1CF407BF53