生物炭和菌根對降低玉米吸收重金屬鎘的聯(lián)合效應(yīng)

張華緯

（長治學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 長治 046011）

當(dāng)前，我國在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域存在土壤重金屬污染問題。其中，由于鎘（Cd）的生物有效性高，與其他重金屬元素相比更易在農(nóng)產(chǎn)品中積累，因而在農(nóng)產(chǎn)品中Cd 超標(biāo)排在首位[1]。Cd 可在土壤-植物系統(tǒng)中遷移，通過食物鏈危害農(nóng)產(chǎn)品安全和人體健康。近年來，關(guān)于植物吸收富集污土中重金屬的研究備受關(guān)注。很多研究表明，生物炭總體上鈍化重金屬的效果顯著，如利用雞糞生物炭對Cd 和Pb 固化效率可達(dá)到88.4%和93.5%[2]。生物炭的鈍化效果還與生物炭種類、用量和熱解溫度等有關(guān)[3,4]。

近年來研究者發(fā)現(xiàn)，采用生物吸附措施也能有效抑制重金屬的生物有效性。其中，叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，以下簡稱AMF）可以通過螯合作用或者過濾作用直接降低植物吸收重金屬[5]；可改善植物生長狀況，提高植物吸收營養(yǎng)元素效率，減輕重金屬對植物的毒害；真菌還能向土壤中分泌一種可與土壤重金屬絡(luò)合的糖蛋白-球囊霉素以絡(luò)合重金屬離子[6]。然而，污染土壤中AMF 對宿主植物生長及吸收重金屬的影響存在差異[7]，可能與不同AMF 種類在侵染率、菌絲生長、植物營養(yǎng)元素運(yùn)輸效率等方面存在差異有關(guān)，直接影響到菌根共生體的生理特性，影響菌根效應(yīng)[8]；也可能與土壤理化環(huán)境有關(guān)，如在缺磷區(qū)可提高對磷素的吸收，從而激發(fā)AMF 的活性[9]。

生物炭或者AMF 的單一作用已被多位研究者證實(shí)。而有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭能通過改變土壤資源儲備（如可利用 C、營養(yǎng)物質(zhì)、水分等）、非生命成分（如 pH、CEC 等）等理化性質(zhì)，加快土壤細(xì)菌和真菌的生長與繁殖[10]，改善AMF的活性和侵染率，使AMF 分泌更多的球囊霉素以絡(luò)合土壤重金屬離子，從而降低重金屬有效性。如Ezawa 等[11]發(fā)現(xiàn)，稻殼生物炭增加了土著真菌（Glomus spp.）的生物量以及對萬壽菊的侵染率；Liao 等[12]發(fā)現(xiàn)棉花秸稈生物炭促進(jìn)了土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的群落豐富度；Zakariam 等[13]研究表明添加桉木生物炭0.6-6 t 兩年后，小麥根部AMF提高了20-40 %，而未添加生物炭僅提高5-20%；Rilling 等[14]發(fā)現(xiàn)生物炭能促進(jìn)真菌共生，從而有效促進(jìn)AM 孢子萌發(fā)。

故筆者猜想將兩者聯(lián)合作用于重金屬污染土壤中，可能優(yōu)于單一的作用效果。兩者的交互效應(yīng)仍未研究并證實(shí)。因此，文章通過將生物炭和AMF 同時(shí)作用于虧磷條件下原位Cd 污染土中，探究生物炭和菌根的協(xié)同作用對玉米生長和吸收富集土壤重金屬鎘的影響，并探究其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

供試植物為玉米（Zea mays L.），品種為鄭丹958，挑選出顆粒飽滿、大小一致的種子。在播種前對玉米種子進(jìn)行催芽，具體催芽方法為：用去離子水沖洗三遍，在10 %的雙氧水（H2O2）中浸泡30 min 后沖洗干凈。將種子置于潤濕培養(yǎng)皿中，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1-2 d 待玉米種子露白后播種。播種時(shí)玉米種子每盆播種2 粒，在玉米三葉期時(shí)間苗，拔除1 顆長勢不齊者，留長勢一致的幼苗一株。

1.1.2 土壤及生物炭

供試土壤采自湖南省衡陽市大浦鎮(zhèn)爐鋪村（112 °47 ″29.38 ′E，27 °00″ 20.77 ′N），為礦區(qū)附近棄耕多年的原位Cd 污染黃棕壤，采集區(qū)域內(nèi)分上、中、下三個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)選擇三個(gè)5 m×5 m 的樣方，樣方中按對角線隨機(jī)取土，取土深度為 0-20 cm。取回風(fēng)干后過2 mm 篩備用。

水稻秸稈采集自江西省豐城市，400 ℃熱解后、研磨過100 目篩制得生物炭。土壤及生物炭理化性質(zhì)見表1、表2。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic properties of the studied soil

表2 供試水稻生物炭基本理化性質(zhì)Table 2 Basic properties of the rice straw biochar

1.1.3 AMF

Funneliformis mosseae（原菌種名為Glomus mosseae，簡稱為G.m）引自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所“叢枝菌根真菌種植資源庫（BGC）”。此菌劑是經(jīng)高粱擴(kuò)繁后得到的含有菌根真菌孢子、宿主植物根段和根外菌絲的砂石混合物。經(jīng)測定，此菌劑的孢子密度為70 個(gè)/10 g 孢子。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采取兩因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素一為生物炭，分為接種生物炭和不接種生物炭；因素二為AMF，分為接種AMF 和不接種AMF。共4 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4 次：對照（CK）、單一添加生物炭處理（BC）、單一添加AMF 處理（AM）、同時(shí)添加生物炭和AMF 處理（BA）。

試驗(yàn)采用規(guī)格為9×10×11 cm 的塑料盆缽作為培養(yǎng)容器（盆缽底部放托盤防止重金屬離子流失），每盆中加入500 g 過2 mm 篩且經(jīng)λ 射線滅菌的土壤，每盆分別按照每千克土壤0.3 g N、0.3 g K 施入尿素和硫酸鉀。施入生物炭的處理按照3.0 %的比例與土壤均勻混合后裝盆，未施入生物炭的處理直接裝盆。加入以上材料混合穩(wěn)定10 d 之后接種AMF 的處理每盆加入15 g 菌劑，不接種AMF的處理每盆加入15 g高溫滅菌菌劑，采用局部接種方式，加入到距離表層2 cm 處，同時(shí)每盆加入10 mL 土壤濾液，以恢復(fù)輻射滅菌前的土壤微生物區(qū)系。將催芽后的玉米種子播種。

試驗(yàn)在智能溫室中進(jìn)行，生長溫度為25℃±2，相對濕度50 %，平均日照時(shí)間為13 h。試驗(yàn)期間根據(jù)玉米的生長習(xí)性適時(shí)適量澆去離子水，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行人工除草除蟲，49 d后收樣。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 植物相關(guān)指標(biāo)

植物生物量：樣品于105 ℃殺青30 min、75℃烘干48 h 至恒質(zhì)量，測定生物量。

植物體內(nèi)重金屬的消解和測定：硝酸微波消解，ICP-MS 法測定。取過10 目植物樣品0.25 g于微波消解管中，加入8.00 mL 硝酸（優(yōu)級純），加蓋密封放入通風(fēng)櫥中過夜；第二天將消解管對稱放入微波消解儀器腔體中，選擇180 ℃、30 min 消解程序，開始消解；待溫度下降到80 ℃以下時(shí)取出消解管，放入160 ℃用于趕酸的電熱板中加熱趕酸50 min；再用超純水將消解液完全轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中并定容，搖勻；再過濾到15 mL 離心管中，過濾液用于ICP-MS 測定重金屬濃度。

1.3.2 土壤相關(guān)指標(biāo)

土壤DTPA 有效態(tài)Cd 的測定：CaCl2-DTPA-TEA 溶液浸提-原子吸收光譜法。取過2 mm 篩的待測土樣5.00 g，加入 DTPA 浸提劑（二乙三胺五乙酸-氯化鈣-三乙醇胺緩沖浸提劑）25.0 mL，在 20-25 ℃、180 r·min-1振蕩2 h，過濾，過濾液采用原子吸收分光光度計(jì)（zenith 700p，德國耶拿）測定過濾液中Cd 濃度。

土壤 pH 采用 pHS-3C 型pH 計(jì)測定。

土壤可溶性有機(jī)碳（DOC）測定：硫酸鉀浸提-分光光度計(jì)比色法[15,16]。稱取過2 mm 篩的土壤5.00 g 于50 mL 離心管中，加入0.5 mol/L 的硫酸鉀浸提劑20 mL，25 ℃下震蕩30 min，用0.45 μm 濾膜抽濾；取得濾液后，取1.00 mL 濾液，用去離子水稀釋到5 mL，然后加2.5 mL，10 mmol/L 的Mn-Ⅲ-焦磷酸和2.5 mL 濃硫酸，搖勻，靜置1 小時(shí)后，用紫外分光光度計(jì)，在490 或500 nm 波長下比色。

土壤球囊霉素相關(guān)蛋白（GRSP）的測定：考馬斯亮藍(lán)比色測定[17]易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白（EE-GRSP）：稱取0.75 g 土樣，加入6 mL，20 mmol/L 檸檬酸緩沖液（pH=7.0），121℃滅菌1 h，然后10000 r/min 離心20 min；難提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白（DE-GRSP）：在提取EE-GRSP 后的殘?jiān)?，加? mL、50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH=8.0），121 ℃滅菌1 h，然后10000 r/min 離心10 min。再采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒（A045-2）進(jìn)行測定。EE-GRSP+ DE-GRSP即為土壤中總球囊霉素。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 辦公軟件和SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。用單因素方差分析（ANOVA）比較不同處理間的差異，置信度95 %水平下，最小顯著差數(shù)法（LSD）比較各處理間的差異顯著程度；用雙因素方差分析比較生物炭、AMF 單一以及聯(lián)合的交互作用；用雙變量相關(guān)分析法分析植物體內(nèi)重金屬含量與土壤DTPA 有效態(tài)重金屬含量及其它土壤相關(guān)因素之間的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 施加生物炭和AMF 對玉米生長的影響

2.1.1 株高

由圖1 可知，施加生物炭比不施加生物炭的處理極顯著增加了玉米株高。到第49 d 時(shí)，添加生物炭的處理平均株高達(dá)到119.68 cm，而不加生物炭株高只有69.06 cm，增加幅度為73.3%。而AM 處理和CK 對照、BA 處理和BC 處理差異不顯著。

圖1 施加生物炭和AMF 對玉米株高的影響Fig.1 The effect of biochar and AM on the height of corn (cm)

雙因素方差分析表明，生物炭的單一作用對玉米株高的促進(jìn)效果極顯著（P=0.000***），AMF 的單一作用以及兩者的交互作用對玉米株高的促進(jìn)效果不顯著（P＞0.05，NS）。

2.1.2 生物量

單因素方差分析表明（表3），AM 處理組與CK 對照組之間無顯著差異，說明添加AMF對玉米生物量無顯著影響；BC 處理組生物量顯著高于CK 對照組，說明添加生物炭顯著增大了玉米生物量；除地上部生物量BC 處理組和BA處理組差異顯著外，地下部、總生物量BC 處理組和BA 處理組差異不顯著。說明總體上同時(shí)施加AMF 和生物炭的處理并沒有優(yōu)于只施加生物炭的單一處理。

表3 施加生物炭和AMF 對玉米生物量的影響Table 3 The effect of biochar and AM on biomass of corn

雙因素方差分析表明，生物炭表現(xiàn)出了極顯著的效應(yīng)（P=0.000***），AMF 的單一效果以及生物炭和AMF 的交互效應(yīng)都不顯著（P＞0.05，NS）。

2.2 施加生物炭和AMF 對玉米鎘濃度的影響

單因素方差分析表明（表4），地上部Cd 含量AM 處理組和CK 無顯著差異，而BC 處理組Cd 濃度顯著低于CK 對照組，說明添加AMF 對玉米體內(nèi)重金屬濃度無顯著影響，生物炭極顯著降低玉米體內(nèi)重金屬含量；BA 與BC 組無明顯差異，說明同時(shí)添加兩者的處理并沒有優(yōu)于只添加生物炭的單一處理。

表4 施加生物炭和AMF 對玉米鎘濃度的影響Table 4 The effect of biochar and AM on Cd of corn

雙因素方差分析表明，生物炭單一作用使得植物地上地下部重金屬含量極顯著降低（P=0.000***），AMF 單一作用對植物Cd 含量無顯著影響（P＞0.05，NS）。生物炭和AMF 交互效應(yīng)雖顯著影響了地下部鎘濃度，但交互效應(yīng)并沒有優(yōu)于生物炭的單一作用（P＞0.05，NS）。

2.3 施加生物炭和AMF 對土壤DTPA-Cd 濃度的影響

BC 處理顯著降低了土壤DTPA-Cd 濃度，而CK 與AM 處理組之間沒有顯著性，BC、BA 處理組之間也沒有顯著性。雙因素方差分析表明（表5），生物炭單一效應(yīng)極顯著（P=0.000***），說明生物炭顯著降低了土壤有效態(tài)Cd 濃度，降低了生物有效性；而AMF 的單一作用效果以及生物炭和AMF 的交互效應(yīng)不顯著（P＞0.05，NS），說明AMF 的添加并沒有降低土壤重金屬的有效性，生物炭、AMF 的聯(lián)合作用也沒有優(yōu)于生物炭的單一作用。

2.4 生物炭和AMF 對pH、DOC、GRSP 的影響

2.4.1 對土壤pH 的影響

單因素方差分析表明（表5），土壤pH 從小到大的排序組別為：AM＜CK＜BC＜BA。也就是說，添加生物炭處理的pH 顯著大于未添加的處理。雙因素方差分析表明，生物炭極顯著升高pH（P=0.000***），AMF 單一作用以及生物炭*AMF 交互作用不顯著（P＞0.05，NS）。

表5 施加生物炭和AMF 對土壤Cd 有效性及相關(guān)指標(biāo)的影響Table 5 The effect of biochar and AM on DTPA-Cd and values

2.4.2 對土壤DOC 的影響

在土壤中，可溶性有機(jī)碳（DOC）作為重金屬的有機(jī)配體，對土壤溶液中的微量重金屬的可移動性和遷移過程以及金屬復(fù)合物的形成過程有著重要作用。它們通過與水體、土壤和沉積物中的金屬離子、氧化物、礦物和有機(jī)物之間的離子交換、吸附、絡(luò)合、螯合、絮凝、氧化還原等一系列反應(yīng),改變重金屬的生物毒性、遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律與最終歸宿[18]。

單因素方差分析表明，添加生物炭處理的DOC 大多數(shù)大于未添加的處理，AMF 對不同處理影響不同。雙因素方差分析表明，生物炭極顯著得導(dǎo)致了DOC 升高（P=0.001**），AMF 的單一作用以及生物炭*AM 真菌交互作用不顯著（P＞0.05，NS）。

2.4.3 對土壤球囊霉素的影響

球囊霉素作為AMF分泌的一種土壤糖蛋白，可與土壤重金屬離子形成絡(luò)合反應(yīng)，降低重金屬的遷移作用。

單因素方差分析表明，土壤GRSP 不同處理之間均無顯著差異。雙因素方差分析表明，AMF的單一作用，以及生物炭*AMF 交互作用均不顯著（P＞0.05，NS）。說明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，AMF幾乎未分泌球囊霉素以發(fā)揮其降低Cd 生物有效性的作用。

2.4 生物炭和菌根的協(xié)同作用對植物吸收富集鎘的影響因素分析

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)在原位鎘污染土壤條件下施用生物炭和AMF，擬探究兩者對植物吸收Cd 的影響。生物炭或者AMF 導(dǎo)致Cd 有效性發(fā)生變化的可能因素都會影響土壤Cd 有效態(tài)濃度變化，從而影響植物對重金屬的吸收富集。為了探究兩者影響Cd 的相關(guān)因素，研究了土壤pH、DOC、GRSP濃度與土壤Cd 有效態(tài)的相關(guān)關(guān)系，再探討土壤鎘含量與植物地上部Cd 濃度的相關(guān)關(guān)系。

土壤不同理化性質(zhì)可能影響土壤中鎘的生物有效性含量。相關(guān)分析表明（表6），與土壤DTPA-Cd 呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系的因素為土壤DOC、pH（P＜0.01**），說明生物炭可通過提高土壤pH 及土壤DOC 含量來降低鎘的生物有效性。GRSP 與DTPA-Cd 相關(guān)分析沒有顯著性，可能是由于Cd 污染程度很高，影響了AMF 繁殖，降低了其分泌球囊霉素的能力以絡(luò)合土壤重金屬離子。土壤DTPA-Cd 與植物地上部Cd 濃度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01**），說明土壤有效態(tài)濃度會影響植物對土壤重金屬的吸收富集。

表6 影響Cd 有效性可能因素的相關(guān)分析Table 6 The correlation of the factors that influence the Cd

3 討論

通過在原位重金屬鎘污染土壤上施用生物炭或接種AMF 來研究兩者對植物吸收富集重金屬鎘的聯(lián)合效應(yīng)，并探討影響重金屬生物有效性的機(jī)理。

3.1 生物炭降低重金屬生物有效性效應(yīng)

本試驗(yàn)中生物炭的作用效果得到了明顯證實(shí)。生物炭顯著促進(jìn)了玉米株高的生長、提高了玉米地上地下部生物量，顯著地降低了植株地上地下部Cd 含量。生物炭對植物生長的促進(jìn)作用以及降低植物體內(nèi)含量的作用在很多研究中被充分證實(shí)，如劉阿梅等[19]發(fā)現(xiàn)生物炭可明顯增加圓蘿卜和小青菜可食部分生物量，Cd 含量分別減少了81.21 %和83.04 %，并且達(dá)到食用標(biāo)準(zhǔn)；Qiao YH 等[20]發(fā)現(xiàn)生物炭有利于玉米植株生物量以及株高的增加；侯艷偉等[21]報(bào)道生物炭可降低油菜可食部分Cd、Pb 的含量，并達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)生物炭對土壤pH 升高效應(yīng)極顯著。本試驗(yàn)中土壤pH 為4.3，為偏酸性，添加pH 為10.51 的生物炭有利于土壤pH 的升高，生物炭對酸性土壤pH 的改良效應(yīng)在很多研究中都有充分體現(xiàn)[22-25]。土壤pH 升高，會結(jié)合土壤水體中易遷移的重金屬離子，影響重金屬在土壤中的遷移性，降低土壤中有效態(tài) Cd 含量，有研究發(fā)現(xiàn)生物炭可在很短的時(shí)間內(nèi)提高土壤pH[26]，也在本基礎(chǔ)研究試驗(yàn)中得到充分證實(shí)。

生物炭可以增加土壤有機(jī)碳含量，促進(jìn)土壤團(tuán)聚體的形成，使得土壤重金屬離子與有機(jī)質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，降低其生物有效性[18]。由于生物炭中C儲備較大，施入土壤中將小分子有機(jī)質(zhì)釋放到土壤溶液中，使其升高。生物炭對土壤可溶性有機(jī)碳的作用在不同研究中不同。章明奎等[27]發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)炭可顯著提高土壤有機(jī)碳的積累，但降低了土壤水溶性有機(jī)碳，而其下降可能與生物質(zhì)炭對其吸附固定有關(guān)；馬莉等[28]發(fā)現(xiàn)了施用生物炭量為5 g/kg、10 g/kg 時(shí)土壤水溶性有機(jī)碳含量顯著高于對照。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)影響土壤DOC 的交互作用是復(fù)雜的，因?yàn)镈OC 在土壤中含量不穩(wěn)定，有時(shí)會與土壤顆粒結(jié)合吸附和釋放導(dǎo)致土壤溶液中DOC 含量的下降或上升，有時(shí)也可能被微生物分解利用而導(dǎo)致變化，且土壤含水量、pH 值也會影響水溶性有機(jī)碳的吸附平衡[29]。

3.2 AMF 降低重金屬生物有效性效應(yīng)

本試驗(yàn)中，AMF 對重金屬生物有效性和植物體內(nèi)重金屬濃度無顯著單一作用。AMF 因無活性以及沒有侵染植物根系，使得其并沒有分泌多余的球囊霉素來絡(luò)合土壤中重金屬以降低有效態(tài)重金屬濃度，從而減少植物吸收重金屬，所以其總體效應(yīng)不顯著。可能是由于Cd 污染程度很高，影響了AMF 繁殖。如張旭紅等[30]研究在0、100、200 mg/kg 的Cu 污染條件下AMF 對旱稻生長的影響發(fā)現(xiàn)，Cu 污染水平越高，AMF 侵染能力越差，200 mg/kg 條件下的侵染率與CK 相比下降了100 %以上；或是土壤的酸性條件不利于G.m 真菌的孢子萌發(fā)，Hayman 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，G.m 不適合酸性土壤，在中性或微堿性條件下孢子萌發(fā)最好。在pH 為6-7 時(shí)促進(jìn)了植物的生長。本試驗(yàn)土壤Cd 濃度嚴(yán)重超標(biāo)且pH 較低，可能影響了AMF 發(fā)揮作用，故未分泌球囊霉素。由于AMF 未發(fā)揮其單一作用，所以AMF 和生物炭的聯(lián)合作用與生物炭單一作用相比并沒有促進(jìn)植物生長，并且降低了重金屬的生物有效性。

4 結(jié)論

生物炭可顯著降低污染土壤中DTPA-Cd 有效態(tài)含量，降低鎘的生物有效性，從而顯著降低了玉米地上地下部Cd 濃度，生物炭也能明顯改善植物的生長狀況以削弱重金屬對其的毒害作用。生物炭主要作用是通過顯著增大土壤pH、DOC 來削弱 DTPA-Cd 有效態(tài)濃度。

而AMF 的單一作用以及生物炭*AMF 的聯(lián)合作用不顯著。AMF 由于土壤酸性過強(qiáng)或土壤Cd 污染嚴(yán)重超標(biāo)導(dǎo)致其很少侵染玉米植物根系，甚至很少存活繁殖，并未通過分泌球囊霉素來發(fā)揮其降低Cd 生物有效性的作用。在本試驗(yàn)中，由于AMF 未發(fā)揮作用，生物炭和AMF 對于降低植物吸收重金屬的聯(lián)合效應(yīng)未體現(xiàn)。生物炭和菌根的聯(lián)合效應(yīng)仍需繼續(xù)研究。