SD大鼠原代海馬神經(jīng)元的一種優(yōu)化培養(yǎng)方法

強婷婷，胡憲文，張 麗

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)安徽普通高校重點實驗室，安徽 合肥 230601)

體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元是研究中樞系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)精神疾病發(fā)病機制的重要細胞模型[1]，該模型具有培養(yǎng)條件易控、機體復(fù)雜因素干擾少、結(jié)果易分析等優(yōu)勢。目前應(yīng)用比較廣泛的培養(yǎng)方法是利用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)基進行神經(jīng)元培養(yǎng)[2-4]。但是，利用10% FBS培養(yǎng)出來的海馬神經(jīng)元混雜了很多膠質(zhì)細胞，常需要加入有絲分裂抑制劑如阿糖胞苷、5-氟-2′脫氧尿苷(5-Fluoro-2-deoxyuridine，F(xiàn)UDR)[5-6]抑制膠質(zhì)細胞的生長。然而，有絲分裂抑制劑的使用在一定程度上會抑制神經(jīng)元生長和分化。因此，本研究提出一種全程無血清的培養(yǎng)方法，并比較無血清培養(yǎng)、FBS培養(yǎng)和FBS+FUDR培養(yǎng)這3種方法培養(yǎng)出來的神經(jīng)元的生長狀態(tài)和純度，為培養(yǎng)出活力好、純度高的原代海馬神經(jīng)元提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 孕(18±1)d SD大鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證編號：SCXK(皖)2017-001。

1.1.2主要器械與試劑耗材 小動物手術(shù)器械一套，不同規(guī)格的玻璃皿一套，高壓蒸汽滅菌及烘干后使用。60 mm培養(yǎng)皿、24孔板、96孔板(CORNING公司，美國)；DMEM/F12培養(yǎng)基、谷胱甘肽(Glutamax)、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA、B-27、Neurobasal培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；5-氟-2′脫氧尿苷、多聚-L-賴氨酸(Poly-L-lysine，PLL)、巰基乙醇、腐胺、硒、胰島素、黃體酮(Sigma公司，美國)；FBS(Lonsera公司，烏拉圭)；葡萄糖、抗熒光淬滅封片液、CCK-8檢測試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，北京)；正常山羊血清、TritonX-100(索萊寶科技有限公司，北京)；微管結(jié)合蛋白2(MAP2)抗體、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)小鼠單克隆抗體(CST公司，美國)；Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG(Thermo公司，美國)。

1.1.3主要儀器設(shè)備 CO2細胞培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀、超凈工作臺(Thermo公司，美國)，倒置相差熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1溶液配制 (1)PLL工作液：25 mg PLL凍干粉劑溶于滅菌后的超純水中，配成0.1 g·L-1，經(jīng)0.22 μm無菌濾器過濾后分裝備用。(2)FUDR：100 mg溶于100 mL無菌超純水中，配成1 g·L-1，經(jīng)0.22 μm無菌濾器過濾后分裝，避光保存。(3)激素混合劑(hormone cocktail，HC)4 mL：25%胰島素(5 kg·L-1)+0.125%黃體酮(1.256 g·L-1)+12.5%腐胺(32.2 g·L-1)+0.25%硒(0.52 g·L-1)+62.125%純水。(4)Neurobasal細胞種植液100 mL：94.5% Neurobasal+1%青-鏈霉素+1%Glutamax+1%葡萄糖(30%)+2%B-27+0.4% HC+0.1% β-巰基乙醇。(5)DMEM/F12細胞種植液100 mL：88% DMEM/F12+10% FBS+1%青-鏈霉素+1% Glutamax。(6)Neurobasal細胞維持液100 mL：96% Neurobasal+2% B-27+1%青-鏈霉素+1% Glutamax。

1.2.2實驗分組 無血清培養(yǎng)組(Serum-free組)：Neurobasal細胞種植液，12 h后換成Neurobasal細胞維持液；胎牛血清培養(yǎng)組(FBS組)：DMEM/F12細胞種植液，12 h后換成Neurobasal細胞維持液；胎牛血清+5-氟-2′脫氧尿苷培養(yǎng)組(FBS+FUDR組)：DMEM/F12細胞種植液，12 h后換成Neurobasal細胞維持液，培養(yǎng)至d 3時加入50 μmol·L-1FUDR。

1.2.3細胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板準(zhǔn)備 眼科鑷紫外線消毒以后將細胞培養(yǎng)專用爬片(直徑14 mm)放置于24孔板中，按照200 μL·cm-2的劑量滴加PLL。若直接將細胞種在60 mm培養(yǎng)皿或者96孔板中則滴加PLL為150 μL·cm-2。包被5 min后用無菌的超純水清洗3遍，超凈臺晾干后待用。

1.2.4SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng) (1)取材：取孕(18±1)d SD大鼠，根據(jù)文獻[7]方法，七氟烷麻醉孕鼠，用75%酒精消毒孕鼠腹部，“V”字形剪開腹部，快速取出胚胎置于培養(yǎng)皿內(nèi)，然后迅速將胎鼠斷頭取腦，放入裝有預(yù)冷的PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，解剖顯微鏡下分離海馬組織，仔細剝離血管膜后將完整的海馬組織置于PBS緩沖液中。(2)消化及離心：在生物安全柜中將海馬組織轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，棄掉上層的PBS，然后加入2 mL 0.25%胰酶(37 ℃預(yù)熱)消化液，用1 mL移液槍吹散組織后再把組織胰酶混合液轉(zhuǎn)移到60 mm培養(yǎng)皿，放在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min。消化結(jié)束后用10% FBS等體積中和胰酶(即為中和液)，用1 mL槍頭輕輕吹打30次，然后等體積分成兩部分，將含海馬細胞的兩份中和液置于離心機中，1 200 r·min-1，離心5 min，棄去中和液，分別加入適量Neurobasal細胞種植液和DMEM/F12細胞種植液，輕柔吹打1 min，重新懸浮細胞并使之變成單細胞懸液。(3)細胞計數(shù)及接種：取10 μL單細胞懸液，滴加在紅細胞計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整接種密度為(2～3)×108個·L-1，14 mm細胞爬片種植400 μL細胞懸液，60 mm培養(yǎng)皿種植3 mL細胞懸液，96孔板種植150 μL細胞懸液，放入CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)換液及純化：培養(yǎng)12 h后，全量換液為Neurobasal細胞維持液。培養(yǎng)d 3后，半量換液，F(xiàn)UDR培養(yǎng)組加入50 μmol·L-1FUDR。每隔3 d更換一次細胞培養(yǎng)液，半量換液。

1.2.5形態(tài)學(xué)觀察 分別在d 1、d 3、d 5、d 7、d 9、d 13、d 17、d 21時間點于倒置顯微鏡明場下觀察海馬神經(jīng)元的細胞形態(tài)并拍照。

1.2.6CCK-8檢測細胞活力 觀察1～21 d 3組海馬神經(jīng)元細胞的活力，每組設(shè)10個復(fù)孔。將細胞懸液調(diào)整密度后種植于96孔板內(nèi)，每孔100 μL細胞懸液，約3萬個細胞。于不同時間點棄去96孔板中的培養(yǎng)基，重新加入Neurobasal細胞維持液，100 μL/孔。再加入10 μL/孔CCK-8溶液，放入CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.7TUNEL染色檢測細胞凋亡 培養(yǎng)至d 7的神經(jīng)元，棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗1次，再加入0.3% Triton X-100室溫通透細胞5 min，加入50 μL/孔TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次，滴加抗熒光淬滅封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，每組選取5個視野計算細胞凋亡比例。

1.2.8免疫熒光檢測細胞純度 培養(yǎng)至d 7的神經(jīng)元，棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛，室溫下固定細胞15 min，PBS洗3遍，每次5 min。每孔加入0.3% TritonX-100，室溫下通透10 min，PBS漂洗3次。每孔加入5%正常山羊血清，37 ℃下封閉40 min。棄去封閉緩沖液，然后每孔加入稀釋后的一抗(稀釋比MAP2 1 ∶50，GFAP 1 ∶300)，4 ℃過夜，PBS洗3次。用眼科鑷取出細胞爬片置于24孔板蓋子上，滴加混有山羊抗兔、山羊抗鼠的二抗(稀釋比均為1 ∶1 000)，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次。在玻片上滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用鑷子夾起爬片反扣于載玻片上，避光存放于濕盒中。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。紅色熒光為MAP2陽性細胞(海馬神經(jīng)元)，綠色熒光為GFAP陽性細胞(膠質(zhì)細胞)，藍色熒光為DAPI染色(細胞核)。神經(jīng)元純度計算方法：MAP2陽性細胞數(shù)/DAPI核染色細胞數(shù)×100%。每次細胞計數(shù)時隨機選取5個視野(顯微鏡下100倍視野范圍)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點初培養(yǎng)時，細胞密度均勻大小一致，懸浮在培養(yǎng)基中，外觀呈圓球狀，胞體透亮。培養(yǎng)至5 h后，絕大部分細胞已貼壁并且分布均勻，細胞呈類球形，略不規(guī)則，胞體透亮度明顯減低，稍有立體感，其中極少數(shù)細胞開始長出軸突和樹突。培養(yǎng)至24 h后，細胞完全貼壁，大部分細胞長出突起，多為雙極和多極細胞。此時細胞胞體呈類球形、橢圓形、漏斗形，胞體周圍出現(xiàn)光暈，細胞立體感增強。培養(yǎng)至d 3后，細胞胞體增大，突起增多變長甚至出現(xiàn)明顯分支。海馬神經(jīng)元細胞開始出現(xiàn)聚集生長現(xiàn)象。培養(yǎng)至d 5后，細胞進一步聚集生長，并且細胞之間突起交織成網(wǎng)狀。培養(yǎng)至d 7～9，神經(jīng)元成熟，胞體飽滿且周圍存在光暈，細胞突起形成豐富致密的網(wǎng)絡(luò)，但難以辨認突起起源。培養(yǎng)至d 13突起形成的網(wǎng)絡(luò)密集且粗壯，大部分細胞內(nèi)部出現(xiàn)空泡。培養(yǎng)至d 17～21，細胞明顯開始衰老，部分胞體皺縮變小，甚至裂解死亡(Fig 1)。

Fig 1 The growth status of primary SD rat hippocampal neurons at different culture time points (Scale bar=50 μm)

2.2 不同培養(yǎng)方法培養(yǎng)時的海馬細胞生長曲線如Fig 2所示，比較3種培養(yǎng)方式下海馬神經(jīng)元在d 1～21各個時間點的細胞活力。與FBS組相比，Serum-free組在d 8～21時細胞活力較高，表明無血清培養(yǎng)方法培養(yǎng)出來的海馬神經(jīng)元更加穩(wěn)定，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)ig 2)。FBS+FUDR組在細胞培養(yǎng)至d 3時加入FUDR，與FBS組相比，加入FUDR 48 h以后細胞活力明顯降低(P<0.05，F(xiàn)ig 2)，并且d 5～21的神經(jīng)元的細胞活力一直低于FBS組(P<0.05，F(xiàn)ig 2)。

Fig 2 The continuous growth curve of hippocampal neurons detected by CCK-8

2.3 細胞凋亡比例如圖3所示，F(xiàn)BS+FUDR組與FBS組相比，細胞凋亡比例增加，表明FUDR可以促進細胞凋亡(P<0.05，F(xiàn)ig 3)。Serum-free組與FBS組相比，細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 3 Cell apoptosis detected with TUNEL staining (400×，Scale bar=20 μm)

2.4 免疫熒光染色下神經(jīng)元純度的鑒定相同種植密度下，Serum-free組MAP2陽性細胞比例高于FBS組(P<0.05，F(xiàn)ig 4，Tab 1)和FBS+FUDR組(P<0.05，F(xiàn)ig 4，Tab 1)，并且GFAP陽性細胞比例比FBS組和FBS+FUDR組低(P<0.05，F(xiàn)ig 4，Tab 1)。FBS+FUDR組與FBS組相比，GFAP陽性細胞比例降低(P<0.05，F(xiàn)ig 4，Tab 1)，表明細胞培養(yǎng)至d 3時加入FUDR可以抑制膠質(zhì)細胞生長，提高神經(jīng)元純度。

Tab 1 Purity of hippocampal neurons cultured by different methods

Fig 4 MAP2 and GFAP immunofluorescence co-staining (Merge2 group picture was×400，Scale bar=20 μm;the rest was×100，Scale bar=100 μm)

3 討論

海馬是神經(jīng)認知領(lǐng)域研究的一個重要腦區(qū)。原代海馬神經(jīng)元直接取材于動物的海馬組織，相對于細胞系能更好的模擬動物體內(nèi)細胞，然而海馬神經(jīng)元在體外不易存活，選擇合適的培養(yǎng)條件是神經(jīng)元培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一。因此，如何獲得高純度、高活性、生存時間較長的原代海馬神經(jīng)元，是一項值得深入研究的課題。本研究提出一種原代神經(jīng)元培養(yǎng)的無血清的優(yōu)化培養(yǎng)方案：以Neurobasal培養(yǎng)基為主，用B-27代替血清，Glutamax代替L-谷氨酰胺的優(yōu)化配方來培養(yǎng)神經(jīng)元。

為了促進神經(jīng)元的貼壁和生長，以往的研究多在原代培養(yǎng)過程中使用了含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，但是FBS為神經(jīng)元生長提供營養(yǎng)的同時也會刺激膠質(zhì)細胞迅速生長[8]。本研究發(fā)現(xiàn)FBS組膠質(zhì)細胞(GFAP陽性細胞)比例達到了10.4%，遠高于Serum-free組。在體外環(huán)境下，膠質(zhì)細胞會釋放細胞毒性因子，促進神經(jīng)細胞凋亡[5]。有研究提出在培養(yǎng)神經(jīng)元過程中使用抗有絲分裂劑FUDR來降低膠質(zhì)細胞比例，因為FUDR可通過減少非神經(jīng)元細胞S期DNA合成的數(shù)量，來發(fā)揮抑制膠質(zhì)細胞生長的作用[9-10]。然而本研究發(fā)現(xiàn)，在細胞生長至d 3后，即使按照FUDR的最低有效劑量(50 μmol·L-1)[11]使用也會給神經(jīng)元帶來持續(xù)性損傷。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，加入FUDR后神經(jīng)元的細胞活力始終低于未加FUDR的FBS組。TUNEL染色結(jié)果也顯示，F(xiàn)BS+FUDR組的細胞凋亡率高于FBS組。因此，含有FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基或者其中再加入了FUDR的培養(yǎng)基都不是最佳的原代神經(jīng)元培養(yǎng)方案。

本研究采用無血清培養(yǎng)配方(Neurobasal+B-27)，其中B-27是非常理想的添加劑，能夠代替血清為神經(jīng)細胞生長提供必需的神經(jīng)因子。實驗結(jié)果顯示，無血清培養(yǎng)可以使神經(jīng)元膠質(zhì)細胞比例降低至3.5%，并且d 8～21培養(yǎng)的神經(jīng)元活性顯著優(yōu)于FBS組，證明無血清培養(yǎng)方案既能促進神經(jīng)元的存活和生長，還能有效抑制非神經(jīng)元的分裂增殖。神經(jīng)元在培養(yǎng)12 h后(神經(jīng)元完全貼壁而膠質(zhì)細胞和細胞碎片未完全貼壁時)全部換液至Neurobasal維持液中生長，可以進一步降低膠質(zhì)細胞比例。此外，優(yōu)化方案中補充了少量細胞生長刺激物(包含硒、腐胺、胰島素、黃體酮)促進神經(jīng)元生長，同時還添加了少量的 β-巰基乙醇能夠清除細胞生長過程中釋放的氧自由基，最大程度上降低血清減少帶來的不利影響。谷氨酰胺是細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生能量和蛋白質(zhì)合成所必需的氨基酸。然而，細胞培養(yǎng)液中的L-谷氨酰胺隨著時間的推移會自發(fā)降解生成氨，會影響蛋白質(zhì)糖基化，降低蛋白質(zhì)產(chǎn)量，降低細胞活力[12]。與L-谷氨酰胺不同，Glutamax添加劑不會自發(fā)分解，因此不會形成氨。相反，加入Glutamax后細胞會根據(jù)需要裂解二肽鍵以釋放L-谷氨酰胺[13]。因此無血清配方中使用Glutamax作為L-谷氨酰胺的直接替代品。這樣既可以防止氨的積累又在長期培養(yǎng)過程中維持了L-谷氨酰胺的新鮮供應(yīng)。

綜上，從3種培養(yǎng)方案各自的SD大鼠胎鼠原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)結(jié)果來看，全程以Neurobasal+B-27培養(yǎng)基為主的無血清培養(yǎng)方法可以在短時間內(nèi)獲得純度更高、活力更好的神經(jīng)元，是建立體外海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)模型的一種優(yōu)化方法。