非水溶性樣品用的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的研制

裴宇盛，陳 晨，趙小燕，高 華，蔡 彤

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

新型制劑及其所用的輔料(膽固醇、蛋黃卵磷脂、乙膠脂丙膠脂共聚物等)多不溶于水，需采用非水性溶劑溶解，如無(wú)水乙醇、二甲基亞砜等。但在進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測(cè)研究過程中，關(guān)鍵一步為供試品陽(yáng)性對(duì)照(回收試驗(yàn))的制備，即向供試品中添加細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。由于目前國(guó)內(nèi)外的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品中均含有聚乙二醇和乳糖等水溶性賦形劑[1-3]，不能溶于非水溶性溶劑，尤其聚乙二醇具有一定表面活性，當(dāng)遇到非水溶性溶劑時(shí)會(huì)在萃取、稀釋等過程中會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，最終使檢驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行[4-6]。

因此，需制備一批專用的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用于新型制劑及其輔料等非水溶性藥品的內(nèi)毒素檢測(cè)，即細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(非水溶性樣品用)。

1 材料與方法

1.1 儀器Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；Multireax型旋渦混合器(德國(guó)Heidolph)；WNE45型恒溫水浴(德國(guó)Memmert公司)；BET-72型內(nèi)毒素測(cè)定儀(天大天發(fā)科技有限公司)MultiFlo FX型多功能微孔板分液器(美國(guó)Biotek公司)。

1.2 試劑細(xì)菌內(nèi)毒素精品原料，購(gòu)于SIGMA公司，批號(hào)：024M4019V，該批原料是使用酚水法從菌號(hào)為O111B4的大腸桿菌中提取制備得到，生物效價(jià)為4×109EU·g-1，由中國(guó)食品藥品檢定研究院分裝為1 mg/支。細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150800-201601。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：購(gòu)于湛江安度斯生物有限公司，貨號(hào)：W-050。鱟試劑：購(gòu)于湛江安度斯生物有限公司；廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；湛江博康海洋生物有限公司；福州新北生化有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品候選品的凍干制備共制備2批標(biāo)準(zhǔn)品候選品。分別于2018年1月24日生產(chǎn)了1批候選品，編號(hào)為A；于2018年4月18日生產(chǎn)了1批候選品，編號(hào)為B。溶液配制的總體積及凍干分裝體積如Tab 1。

Tab 1 Preparation of standard solution and divide volume

具體操作：取細(xì)菌內(nèi)毒精品2支，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，封口膜封口后在旋渦混合器上混勻15 min，然后用刻度吸管將精品溶液吸出，放入裝有200 mL滅菌蒸餾水的1 000 mL錐形瓶中，重復(fù)2次，在磁力攪拌器上混勻30 min。分別加入內(nèi)毒素檢查用水補(bǔ)至Tab 1中規(guī)定的體積，在4 ℃下混合攪拌2 h。然后將溶液灌裝于2 mL的安瓿中，每支裝量按Tab 1中的分裝體積制備。約2.5 h時(shí)結(jié)束，放入凍干機(jī)進(jìn)行48 h凍干之后機(jī)器封口。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)標(biāo)定該標(biāo)準(zhǔn)品是用于非水溶性新型制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，在檢測(cè)中使用的方法主要為凝膠法、動(dòng)態(tài)濁度法和動(dòng)態(tài)顯色法。故使用以上三種內(nèi)毒素檢查方法，以現(xiàn)行的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(150800-201601)為基準(zhǔn)，采用組織協(xié)作標(biāo)定的形式，對(duì)2批候選品進(jìn)行效價(jià)的標(biāo)定。候選品A預(yù)估效價(jià)為每支800 EU；候選品B預(yù)估效價(jià)為每支2 500 EU。參加本次協(xié)作標(biāo)定的單位共13家，標(biāo)定單位名稱及各單位所使用的方法詳見Tab 2。

Tab 2 Information of laboratories participating in collaborative calibration

1.4.1標(biāo)定方法要求 標(biāo)定具體方法參考《中國(guó)藥典》2015年版四部附錄1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。其中凝膠法標(biāo)定數(shù)量為：每個(gè)協(xié)作單位提供候選品A、B各3支，共6支。要求使用2個(gè)批號(hào)的凝膠法鱟試劑，分別對(duì)6支候選品進(jìn)行效價(jià)標(biāo)定。其中動(dòng)態(tài)濁度法或動(dòng)態(tài)顯色法標(biāo)定數(shù)量為：每個(gè)協(xié)作單位提供A、B批候選品各3支，共6支。要求使用1個(gè)批號(hào)的光度法鱟試劑，對(duì)6支候選品進(jìn)行效價(jià)標(biāo)定。

最終將標(biāo)定結(jié)果匯總統(tǒng)計(jì)，在2批候選品中選擇3種方法標(biāo)定結(jié)果間差異小且可信限率小的1批，作為新型制劑專用的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4.2協(xié)作標(biāo)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)與定值 因生物測(cè)定方法所得數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值方為正態(tài)分布，故生物測(cè)定方法的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均采用其對(duì)數(shù)值進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 各單位標(biāo)定結(jié)果匯總具體結(jié)果見Tab 3～8。

Tab 3 Results of Gel clot test of candidate A

Tab 4 Results of Gel clot test of candidate B

Tab 5 Results of kinetic turbidimetric assay of candidate A

Tab 6 Results of kinetic turbidimetric assay of candidate B

2.2 標(biāo)定結(jié)果匯總統(tǒng)計(jì)分析按照細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的統(tǒng)計(jì)方法，經(jīng)匯總統(tǒng)計(jì)、分析計(jì)算，標(biāo)定結(jié)果見Tab 9,10。

為檢驗(yàn)每批候選品3種方法標(biāo)定的結(jié)果間差異有無(wú)顯著性，是否能夠合并計(jì)算，使用方差分析對(duì)3種標(biāo)定方法的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表11。

經(jīng)檢驗(yàn)，候選品B的3種方法的標(biāo)定結(jié)果間差異均有顯著性，候選品A的3種方法的標(biāo)定結(jié)果間差異無(wú)顯著性。

候選品B需使用卡方檢驗(yàn)，對(duì)每種方法的權(quán)重進(jìn)行校正，使用校正后的權(quán)重，對(duì)3種方法的結(jié)果進(jìn)行加權(quán)平均，最終得到效價(jià)值和可信限率。候選品A可直接對(duì)3種方法的結(jié)果進(jìn)行加權(quán)平均，得到效價(jià)值和可信限率。

2.3 效價(jià)定值按照細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算，結(jié)果顯示，候選品A的3種方法的標(biāo)定結(jié)果間差異無(wú)顯著性，可信限率最小。最終選擇候選品A為細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(非水溶性樣品用)，并根據(jù)國(guó)際上內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)取整原則，將其效價(jià)定值為每支700 EU。

Tab 12 Potency and FL/%

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的均一性研究細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(非水溶性樣品用)的使用方法為整支復(fù)溶后一次性使用。故符合瓶?jī)?nèi)均勻性較好的前提，可以使用簡(jiǎn)化法均勻性方差分析。方案為抽取12支樣品，使用動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)其中11瓶測(cè)量一次計(jì)算，計(jì)算其方差作為其組間方差S1；其余1支樣品重復(fù)測(cè)量4次，計(jì)算其方差作為組內(nèi)偏差S2。每次測(cè)量均為2個(gè)平行孔。詳見Tab 13。

Tab 13 Uniformity test results

2.5 非水溶性樣品檢測(cè)試驗(yàn)大豆油(供注射用)在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時(shí)，需要將細(xì)菌內(nèi)毒素預(yù)先添加到大豆油中，通過回收試驗(yàn)檢測(cè)出已知添加量的細(xì)菌內(nèi)毒素，回收率結(jié)果應(yīng)在50%～200%之間，而其他細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品只能用水來復(fù)溶，復(fù)溶后添加到大豆油中會(huì)產(chǎn)生分層。若直接用大豆油溶解其他內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品則會(huì)出現(xiàn)渾濁，影響進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

使用本標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)，用0.5 mL大豆油溶解標(biāo)準(zhǔn)品，混勻時(shí)間不少于15 min，再進(jìn)行稀釋或者萃取等步驟，如采用加入等體積細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，萃取15 min，靜止取水相進(jìn)行檢測(cè)，其回收率在50%～200%，說明該萃取方法能將內(nèi)毒素提取。

3 討論

3.1 結(jié)果分析本次標(biāo)定結(jié)果中，候選品B的RSD值非常高，最高達(dá)151.4%，表明支間差異很大。分析原因，是由于本標(biāo)準(zhǔn)品不能使用賦形劑造成的。在內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備凍干的生產(chǎn)過程中，賦形劑不僅起到使標(biāo)準(zhǔn)品成形的支架作用，還可以幫助內(nèi)毒素在分裝前的水溶液中分散更均勻、在凍干過程中減少升華損失，以上作用均可降低標(biāo)準(zhǔn)品凍干后的支間差異。但本標(biāo)準(zhǔn)品不能使用賦形劑，對(duì)分裝、凍干工藝的要求比其他標(biāo)準(zhǔn)品高。從標(biāo)定數(shù)據(jù)也可以看出，候選品A的RSD比候選品B小很多，說明其產(chǎn)品的支間差異較小，生產(chǎn)工藝的精度更好。

雖然無(wú)賦形劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與有賦形劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，支間差異略大，但其可信區(qū)間在內(nèi)毒素檢測(cè)的可接受范圍內(nèi)(50%～200%)，不會(huì)影響到內(nèi)毒素檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.2 應(yīng)用性此批標(biāo)準(zhǔn)品不僅可用于新型制劑及其輔料的內(nèi)毒素檢測(cè)，其他非水溶性藥品均可使用該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備供試品的陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)毒素的檢測(cè)。故命名其為“細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(非水溶性樣品用)”。為了避免與現(xiàn)有細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)結(jié)果沖突，該標(biāo)準(zhǔn)品作為現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品在特殊情況無(wú)法使用時(shí)的補(bǔ)充。

以膽固醇(供注射用)為例：膽固醇在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時(shí)，無(wú)法將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品直接添加到膽固醇中，需要用乙醇溶解膽固醇，用水溶解內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，需要預(yù)先摸索合適的微量高濃度內(nèi)毒素添加到膽固醇的乙醇溶液中，否則膽固醇或者乳糖會(huì)析出體系。使用本標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)，用膽固醇乙醇溶液直接溶解標(biāo)準(zhǔn)品，則直接完成了供試品陽(yáng)性對(duì)照。