基于TLR4/NF-κB/MyD88通路探討清解化攻方抑制雨蛙素誘導(dǎo)重癥急性胰腺炎模型大鼠炎癥反應(yīng)的生信分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

秦百君,唐曦平,楊 昕,卜獻(xiàn)忠,宮文浩,陳月橋,陳國忠

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,廣西 南寧 530021；廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是多種病因引起的胰蛋白酶異常激活、胰腺組織水腫壞死及炎癥介質(zhì)大量釋放,繼發(fā)全身炎癥性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征的急危重癥,包括中國在內(nèi)的亞洲國家本病發(fā)病率約(36～125)/10萬人,在急性胰腺炎患病人數(shù)中占比約20%,死亡率可達(dá)6.5%～26%,患病進(jìn)展迅速,預(yù)后兇險(xiǎn)[1-3]。SAP發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,其中“炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子學(xué)說”在闡述SAP發(fā)病進(jìn)展過程具有重要地位,由于胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)廣泛的酶激活現(xiàn)象能夠促使腺體自溶、細(xì)胞壞死,從而釋放大量炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子入血,進(jìn)而引起氧自由基產(chǎn)生和血管損傷,級(jí)聯(lián)式炎癥反應(yīng)加重多器官損傷[4]。而TLR4/NF-kB/MyD88信號(hào)通路是關(guān)鍵的炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,可調(diào)控多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá),該通路活化在SAP發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[5]。

清解化攻方(QingJieHuaGong decoction, QJHGD)是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療SAP名醫(yī)驗(yàn)方的院內(nèi)制劑,已在我院及醫(yī)聯(lián)體合作單位使用多年,臨床療效顯著[6],目前復(fù)方已獲得國家發(fā)明專利(專利號(hào)：ZL201811021893.2)。課題組前期實(shí)驗(yàn)證明QJHGD對(duì)SAP大鼠可減少胰腺出血、降低壞死程度,減輕炎癥細(xì)胞浸潤,但具體機(jī)制未明。本研究結(jié)合生信數(shù)據(jù)分析,構(gòu)建QJHGD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并富集相關(guān)信號(hào)通路,通過雨蛙素聯(lián)合脂多糖(caerulein-lipopolysaccharide,CAE-Lps)復(fù)制SAP大鼠模型,揭示QJHGD通過調(diào)控TLR4/NF-κB/MyD88信號(hào)通路從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、緩解胰腺炎病情的作用。

1 材料與方法

1.1 QJHGD網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

1.1.1在線數(shù)據(jù)庫及分析軟件 中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php及https：//www.tcmsp-e.com)、TCMID(http：//www.megabionet.org/tcmid/);藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫BATMAN TCM (http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、swiss target prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/);疾病數(shù)據(jù)庫GeneCards(www.genecards.org/)、TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)、pharmgkb(www.pharmgkb.org/)、Drugbank(https：//go.drugbank.com/)。蛋白互作用String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)、蛋白數(shù)據(jù)庫Uniprot(https：//www.uniprot.org)?；蚬δ茏⑨尵W(wǎng)站Metascape(https：//metascape.org/)。作圖工具Cytoscape 3.7.1、yihanbo網(wǎng)站(http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/)。

1.1.2QJHGD活性成分及靶點(diǎn)篩選 利用TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫檢索QJHGD中柴胡、大黃、厚樸、黃芩、木香、桃仁、枳實(shí)7味中藥的化學(xué)成分,篩選條件滿足“Lipinski類藥原則”,且藥物相似度DL≥0.18、口服生物利用度OB≥30%、Caco-2細(xì)胞表觀滲透系數(shù)≥-0.4。刪除人工檢索無文獻(xiàn)支撐的化合物,結(jié)合參考文獻(xiàn)及PubChem數(shù)據(jù)庫結(jié)果,將沒有滿足藥動(dòng)學(xué)參數(shù)化合物去掉,最終保留QJHGD有效成分。篩選后的活性成分結(jié)合Pubchem、swiss target prediction逐一配對(duì)潛在藥物作用靶點(diǎn),綜合BATMAN TCM數(shù)據(jù)庫結(jié)果,得到QJHGD作用靶點(diǎn)集合。gene symbol通過UniProt數(shù)據(jù)庫注釋。

1.1.3SAP疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“Severe acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞,綜合GeneCards、TTD、OMIM、pharmgkb、Drugbank數(shù)據(jù)庫收集SAP相關(guān)疾病靶點(diǎn),將QJHGD作用靶點(diǎn)集合與SAP疾病靶點(diǎn)交互映射,以交集韋恩圖形式展示QJHGD干預(yù)SAP的相關(guān)靶點(diǎn)集。

1.1.4蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)輸入String網(wǎng)站,構(gòu)建蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)圖。選擇“Muitiple proteins”,物種“Homo sapiens”,置信度設(shè)置為>0.90。

1.1.5“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 藥物有效成分與QJHGD干預(yù)SAP的靶點(diǎn)集相互映射,成分靶點(diǎn)逐一匹配,借助Cytoscape 3.7.1軟件繪制QJHGD干預(yù)SAP的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.6GO和KEGG富集分析 Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,P<0.05。選擇富集數(shù)目最多的前20個(gè)條目在yihanbo網(wǎng)站分別繪制GO和KEGG氣泡圖。

1.2 CAE-Lps誘導(dǎo)SAP模型大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1動(dòng)物 6～8周齡♂ SPF級(jí)SD大鼠40只,體質(zhì)量(200±20) g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004。大鼠于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[SYXK(湘)2019-0001],飼養(yǎng)條件：濕度55%～65%、溫度(24±2)℃、光暗循環(huán)12 h·d-1。實(shí)驗(yàn)所涉及動(dòng)物飼養(yǎng)符合福利標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2藥品與試劑 QJHGD實(shí)驗(yàn)處方：柴胡、大黃、厚樸、黃芩、木香、桃仁、枳實(shí),由廣西中醫(yī)藥大學(xué)一附院煎藥室制備,廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源中心鑒定藥材符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。藥材加10倍蒸餾水浸泡24 h,先武火煮沸,后文火繼續(xù)煮30 min,濾出藥液常法下煎煮3次,過濾藥液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,配制1 kg·L-1生藥。注射用烏司他丁(規(guī)格2 mL：10萬IU,廣東天普洛安生物,貨號(hào)031905103)。Elisa試劑：大鼠α-AMS(賽默飛DG96286Q-96T)、大鼠脂肪酶(賽默飛DG96276Q-96T)、大鼠IL-6(武漢云克隆L210405259)、大鼠TNF-α(上海酶聯(lián)m1064303-C)等試劑盒。免疫組化試劑：蘇木素-伊紅染色試劑盒(索萊寶,貨號(hào)G1120),DAB顯色試劑盒(中杉金橋,貨號(hào)ZLI-9018),TLR4一抗(賽默飛,貨號(hào)13-9924-81),NF-κB P65一抗(賽默飛,貨號(hào)PA5-27617),MyD88一抗(賽默飛,貨號(hào)PA5-19918),二抗通用二步法檢測(cè)試劑盒(大鼠增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng),貨號(hào)PV-9000)。雨蛙素(上海源葉生物,貨號(hào)S62702),脂多糖(上海源葉生物,貨號(hào)S11060)。

1.2.3儀器 Centrifuge5804R離心機(jī)(德國艾本德)；ThermoFisher Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀(美國賽默飛)；ZKPJ-1A烤片機(jī)(天津愛華);Histostar組織包埋機(jī)(美國賽默飛)；ASP300S封閉式組織脫水機(jī)(德國徠卡)；Coverslipper CS500全自動(dòng)智能染色封片一體機(jī)(中國達(dá)科為)；電子顯微鏡(德國徠卡)。

1.2.4動(dòng)物造模 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組、西藥組,每組各10只,造模前24 h禁食不禁水。造模采用雨蛙素注射法[7],將雨蛙素用DMSO溶解后予0.9%生理鹽水稀釋成5 mg·L-1,參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8],根據(jù)臨床體重折算,模型組及各給藥組大鼠予50 μg·kg-1CAE腹腔注射,每小時(shí)注射1次,連續(xù)6次,第7次注射LPS 10 mg·kg-1復(fù)制SAP模型。注射結(jié)束后,中藥組予QJHGD溶液灌胃7 g·kg-1(等同于臨床等效劑量,且該劑量為前期實(shí)驗(yàn)確定最佳劑量故未設(shè)量效組別),正常組、模型組予相同容積生理鹽水灌胃,西藥組予烏司他丁皮下注射,按臨床用量折算為2萬IU·kg-1,每天2次,連續(xù)3 d。給藥完成后,予腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉。

1.2.5QJHGD對(duì)SAP大鼠血清淀粉酶、血清脂肪酶活性及炎癥因子表達(dá)水平的影響 取材時(shí)充分暴露腹主動(dòng)脈,置入套管針采血,留取血液標(biāo)本,留取的血液標(biāo)本在室溫下放置2 h,然后在4 ℃下高速離心機(jī)以3 500 r·min-1離心10 min,取上層血清分裝于試管中。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測(cè)各組血清淀粉酶、血清脂肪酶、IL-6、TNF-α的OD值,繪制樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線并換算濃度。

1.2.6蘇木精-伊紅染色法觀察QJHGD對(duì)SAP大鼠胰腺組織病理改變的影響 胰腺體部位取材,4%多聚甲醛固定,后石蠟包埋切片,予37 ℃恒溫箱烤片1 h,二甲苯和無水乙醇脫蠟水化。切片經(jīng)蘇木精染色液染色5 min,分化液分化后予自來水浸泡,后將切片置于伊紅染液1 min,自來水洗凈切片,最后予脫水、透明、封片,鏡下觀察包含QJHGD中藥組在內(nèi)的各組SAP大鼠胰腺組織病理改變情況。

1.2.7免疫組化法檢測(cè)胰腺組織TLR4/NF-kB/MyD88通路關(guān)鍵蛋白表達(dá) 石蠟切片于65 ℃烤片后予檸檬酸鈉修復(fù)液浸泡并機(jī)器高壓(100 ℃,100 kPa)修復(fù)1 h,阻斷封閉之后,根據(jù)抗體說明書將抗體按1 ∶100比例稀釋,孵育TLR4、NF-κB、MyD88一抗,存放在濕盒中4 ℃冰箱過夜。24 h后取出PBS洗滌3次,二抗滴片,孵育20 min后,洗凈加入DAB顯色液,后予蘇木精復(fù)染轉(zhuǎn)藍(lán),脫水、封片。Image pro plus6軟件分析并計(jì)算平均光密度,測(cè)算方法參考李楓等[9]文獻(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)QJHGD防治SAP的成分及靶點(diǎn)

2.1.1QJHGD有效成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫共收集到QJHGD成分1 415種,刪除重復(fù)化合物,滿足類藥性DL、口服生物利用度OB、Caco-2細(xì)胞模型條件及Lipinski類藥原則,選擇具有良好ADME特性的化合物,并去除人工檢索無文獻(xiàn)支撐的成分。重新納入文獻(xiàn)研究中槲皮素(quercetin)、橙皮苷(hesperidin)等滿足藥動(dòng)學(xué)參數(shù)條件的藥效分子。最終確定Sainfuran、aloe-emodin、Magnolol等QJHGD有效成分105種化合物,其中柴胡13種、大黃10種,厚樸8種,黃芩32種,木香5種,桃仁18種,枳實(shí)19種,部分成分見Tab 1。篩選后的活性成分結(jié)合Pubchem、Swiss target prediction逐一配對(duì)潛在藥物作用靶點(diǎn),綜合BATMAN TCM數(shù)據(jù)庫結(jié)果,得到QJHGD作用靶點(diǎn)189種。

Tab 1 Information of main active ingredients in QJHGD*

2.1.2SAP疾病相關(guān)靶點(diǎn) 通過對(duì)GeneCards、TTD、OMIM、pharmgkb、Drugbank數(shù)據(jù)庫逐一檢索,分別收集到SAP相關(guān)靶點(diǎn)個(gè)數(shù)為6 989、12、147、121、12。5個(gè)數(shù)據(jù)集取并集后共得到SAP相關(guān)靶基因個(gè)數(shù)7 039。各數(shù)據(jù)集之間映射情況如Fig 1所示。

Fig 1 Vertical Venn diagram of SAP target gene

2.1.3QJHGD防治SAP重要靶點(diǎn)及蛋白互作用網(wǎng)絡(luò) QJHGD干預(yù)的189個(gè)中藥靶點(diǎn)和7 039個(gè)SAP疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集后,得到QJHGD防治SAP的共同作用靶點(diǎn)167個(gè),見Fig 2。在String網(wǎng)站輸入該共同靶點(diǎn)集合,刪除無效靶點(diǎn)后,得到124個(gè)重要靶點(diǎn)集合,見Fig 3。

Fig 2 Venn diagram on intersection genes of QJHGD-SAP

Fig 3 PPI network of QJHGD in treatment of severe acute pancreatitis

2.1.4QJHGD防治SAP的“中藥-成分-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 105種QJHGD中藥有效成分和124個(gè)SAP疾病重要靶點(diǎn)輸入Cytoscape繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)中含有318個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 167條邊。菱形代表疾病靶點(diǎn),圓形代表中藥成分,不同顏色的圓形節(jié)點(diǎn)代表不同的中藥,體現(xiàn)了QJHGD多成分、多靶點(diǎn)、多途徑防治SAP的特點(diǎn),見Fig 4。其中,TLR4、NF-κB、Myd88靶點(diǎn)被柴胡、枳實(shí)、大黃、木香、黃芩、厚樸的中藥有效成分交叉映射。Toll樣受體4信號(hào)傳遞蛋白(Toll-like receptor4,TLR4)是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的門戶啟動(dòng)蛋白,在SAP胰腺腺泡細(xì)胞和腸黏膜上皮細(xì)胞均有廣泛分布；核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)被認(rèn)為是SAP瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游靶點(diǎn),可上調(diào)免疫炎性相關(guān)的趨化因子、黏附因子表達(dá),促成炎癥反應(yīng)不斷放大加重器官損害；髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor88,MyD88)作為Toll通路下游重要的接頭蛋白,在炎癥免疫通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。上述3個(gè)靶點(diǎn)可能是QJHGD拮抗SAP炎癥反應(yīng)發(fā)揮調(diào)控作用的途徑之一。

Fig 4 Network diagram on “TCM - component - target” of QJHGD

2.1.5GO和KEGG富集分析 QJHGD防治SAP重要靶點(diǎn)輸入Metascape進(jìn)行功能和通路富集分析。GO富集分析得到生物過程條目1 814、細(xì)胞組分條目94個(gè)、分子功能條目172個(gè)。生物過程包含脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物反應(yīng)等過程；細(xì)胞組分涉及細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等；分子功能包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)胺受體激活等,見Fig 5。KEGG通路富集分析,共富集到320條不同通路,其中Fig 6所示,Toll樣受體經(jīng)典通路與NF-κB通路為本研究關(guān)注的靶向通路。通路富集分析也進(jìn)一步驗(yàn)證和揭示QJHGD可能通過調(diào)控Toll樣受體、NF-κB經(jīng)典通路從而發(fā)揮防治SAP作用,富集結(jié)果與中藥作用的重要靶點(diǎn)相契合。后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)圍繞TLR4/NF-kB/MyD88通路蛋白表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

Fig 5 GO biological function enrichment analysis

Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis

2.2 動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1QJHGD對(duì)SAP大鼠血清淀粉酶、脂肪酶活性及IL-6、TNF-α含量的影響 相比于正常組,模型組大鼠血清中的淀粉酶、脂肪酶活性均升高(P<0.05)；中藥組和西藥組兩者水平較模型組低(P<0.05)；中藥組與西藥組相比,血清淀粉酶活性降低,血清脂肪酶活性表達(dá)差異不明顯。模型組大鼠TNF-α、IL-6含量較正常組、各給藥組比較均升高(P<0.05)；中藥組IL-6含量明顯低于模型組(P<0.05)。上述結(jié)果說明QJHGD可有效降低SAP模型大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、IL-6、TNF-α表達(dá)水平,抑制大鼠炎癥反應(yīng)(Fig 7)。

Fig 7 Effect of QJHGD on expression of inflammatory factors in SAP n=6)

2.2.2QJHGD對(duì)SAP大鼠胰腺組織病理的影響 SAP模型大鼠胰腺組織病理檢查顯示,正常組大鼠胰腺小葉、腺泡結(jié)構(gòu)均正常,組織結(jié)構(gòu)縝密,未出現(xiàn)明顯的水腫、充血、炎性浸潤；模型組部分區(qū)域胰腺腺泡萎縮,炎細(xì)胞浸潤,組織水腫及顯著空泡樣改變；中藥組和西藥組中胰腺腺泡結(jié)構(gòu)大部分尚存,僅見少量壞死及輕度水腫(Fig 8)。

Fig 8 Effect of QJHGD on pancreatic pathology in SAP model rats(HE staining, ×200)

2.2.3QJHGD對(duì)SAP大鼠胰腺TLR4/NF-kB/MyD88信號(hào)通路的影響 正常組胰腺組織結(jié)構(gòu)完整,TLR4 、NF-κB、MyD88陽性表達(dá)尚淺；模型組可見大量胞質(zhì)TLR4、NF-κB陽性染色細(xì)胞和胞核MyD88陽性染色細(xì)胞；與正常組相比,模型組TLR4、NF-κB、MyD88表達(dá)均增高(P<0.05),陽性表達(dá)區(qū)域明顯增多。中藥組腺泡結(jié)構(gòu)基本完整,TLR4、NF-κB、MyD88陽性染色細(xì)胞較模型組和西藥組明顯減少；與西藥組相比,中藥組TLR4、NF-κB陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05),中藥組MyD88陽性表達(dá)差異不明顯(P<0.05)(Fig 9-10)。

Fig 9 Expression of TLR4, NF-κB and Myd88 in pancreatic of mice in each group(immunohistochemical method ×200)

Fig 10 IOD value of TLR4, NF-κB and Myd88 in pancreatic tissues of each group of n=6)

3 討論

重癥急性胰腺炎是急性胰腺炎伴有持續(xù)性臟器功能障礙、全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能衰竭的臨床常見急危重癥。在SAP早期及時(shí)予不同治療手段干預(yù),如中藥鼻飼、灌腸、外敷等,中西醫(yī)結(jié)合多途徑緩解病情十分重要。中醫(yī)理論認(rèn)為本病屬于濕熱瘀濁絞結(jié)于中焦及腸道,日久成毒,耗氣傷陰,治療上當(dāng)“清熱化濕解毒、化瘀攻下存陰”并舉[10]。清解化攻方是遵從上述治則,長期廣泛使用確有療效的臨床協(xié)定處方,該方由柴胡等7味中藥精心組合,以通腑瀉濁的小承氣湯為基礎(chǔ),配理氣化濕、活血祛瘀、清熱解毒藥共奏蕩滌毒邪、存陰護(hù)陽的作用。清解化攻方臨床療效確切,但作用靶點(diǎn)、通路機(jī)制等尚不明確。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子生物學(xué)方法,探究清解化攻方治療重癥急性胰腺炎的作用機(jī)制。

Fig 11 Schematic diagram of QJHGD inhibiting

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多數(shù)據(jù)庫收集清解化攻方化學(xué)成分,篩選滿足Lipinski類藥原則且藥物相似度DL≥0.18、口服生物利用度OB≥30%、Caco-2細(xì)胞表觀滲透系數(shù)≥-0.4要求,結(jié)合PubChem數(shù)據(jù)庫,最終保留QJHGD有效成分105種。清解化攻方中柴胡的主要成分柴胡皂苷是天然的皂苷類化合物,有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、促酶分泌等作用,雷霏等[11]報(bào)道柴胡皂苷可通過抑制c-fos、c-jun mRNA及蛋白表達(dá)改善胰腺炎大鼠胰腺外分泌功能,進(jìn)而抑制胰腺酶蛋白過度合成抑制胰腺炎病情進(jìn)展。大黃中主要成分為蒽醌類中的大黃素、大黃酸,可調(diào)節(jié)血脂、抗血小板聚集、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等,伍洋等[12]研究表明，TLR4高表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程,大黃素可通過下調(diào)TLR4等免疫因子的表達(dá),恢復(fù)Treg/Th17免疫平衡,緩解SAP炎癥反應(yīng)；蔡丹莉等[13]通過開腹胰膽管注射?；悄懰徕c復(fù)制SAP動(dòng)物模型,也證實(shí)了大黃素可調(diào)節(jié)大鼠胰腺及肺組織Toll樣受體4水平從而發(fā)揮抗炎作用。厚樸酚有抗炎抗菌、抗病原微生物,抗?jié)?抗氧化,抗腫瘤等作用,王燕等[14]研究表明，厚樸酚可抑制HMGB1-TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,降低炎癥因子水平,緩解SAP及SAP相關(guān)肺損傷病情；另外,厚樸多酚清除氧自由基、改善微循環(huán)血流灌注對(duì)于緩解胰腺炎病情也發(fā)揮重要作用。黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分,Jingmin等[15]報(bào)道了黃芩苷可抑制胰腺組織中NF-κB表達(dá),減輕胰腺炎癥反應(yīng),這與枳實(shí)的有效成分皂苷可抑制胰酶活性發(fā)揮抗炎作用類似。木香包含萜類、黃酮等多種成分,木香烴內(nèi)酯作為其活性成分之一,可有效抑制脂多糖誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生和NF-κB活化,抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[16]。蘭濤等[17]報(bào)道了桃仁提取物可顯著降低SAP大鼠TLR4和NF-κB p65的mRNA水平改善其免疫功能。上述實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)研究表明,清解化攻方中藥的主要組分在抑制胰腺炎炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB p65通路表達(dá)方面具有重要作用。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)GO和KEGG富集分析,結(jié)果表明清解化攻方防治SAP的生物學(xué)過程包括對(duì)無機(jī)物質(zhì)響應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等,交集靶點(diǎn)涉及PI3K-Akt、Toll樣受體、NF-κB等經(jīng)典信號(hào)通路。SAP炎癥發(fā)生與模式識(shí)別受體識(shí)別病原相關(guān)分子模式,引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答、同時(shí)釋放炎癥介質(zhì)相關(guān)。Toll樣受體家族作為重要的炎癥識(shí)別受體,該類跨膜蛋白能識(shí)別受體及復(fù)合物的胞外區(qū)域,從而激發(fā)下游分子通路。TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)的I型跨膜蛋白受體,其胞內(nèi)區(qū)的TIR結(jié)構(gòu)域可與接頭蛋白Myd88死亡結(jié)構(gòu)域和中間域相結(jié)合,募集并分離集白介素受體相關(guān)激酶(IL-receptor-associated kinase,IRAK),與腫瘤壞死因子受體結(jié)合后激活下游通路的NF-κB誘導(dǎo)激酶((NF-κB inducing kinase,NIK),活化NIK進(jìn)一步激活I(lǐng)κB激酶,后者通過與NF-κB復(fù)合物解聚,暴露核序列從而激發(fā)核轉(zhuǎn)錄因子途徑,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[18]。在本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,通過腹腔注射雨蛙素和脂多糖復(fù)制SAP大鼠模型,該方法相比膽胰管逆行注射?；悄懰徕c操作易行,造模成功率高,可穩(wěn)定復(fù)制SAP模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠的血清淀粉酶、血清脂肪酶、IL-6、TNF-α活性較正常組相比均明顯升高,胰腺組織部分區(qū)域胰腺腺泡萎縮,炎細(xì)胞浸潤,組織空泡樣病變,TLR4通路活化,NF-κB p65、MyD88蛋白的陽性表達(dá)明顯升高；中藥組大鼠血清中的淀粉酶、脂肪酶、IL-6、TNF-α等炎癥因子表達(dá)水平明顯降低,胰腺結(jié)構(gòu)基本完整,無明顯水腫充血,TLR4表達(dá)下調(diào),NF-κB p65活化抑制,MyD88蛋白陽性表達(dá)降低。結(jié)果說明清解化攻方可通過下調(diào)TLR4/NF-kB/MyD88信號(hào)通路發(fā)揮抑制SAP大鼠炎癥反應(yīng)的作用,該結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG富集的靶向信號(hào)通路相契合。

綜上,本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)生信數(shù)據(jù)分析,并通過雨蛙素聯(lián)合脂多糖復(fù)制大鼠疾病模型,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了清解化攻方改善重癥急性胰腺炎大鼠胰腺損傷的作用機(jī)制之一,可能與通過下調(diào)TLR4/NF-κB/MyD88通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)相關(guān),機(jī)制示意圖見Fig 11。